同仁化学　アポトーシス(Annexin V)プレートアッセイキット

＜100 テスト＞

コンポーネント	数量	備考
Annexin V - FITC	1本	ホスファチジルセリンと結合する Annexin V に蛍光色素である FITC を標識
Quenching Buffer	11 mL × 1本	蛍光標識 Annexin V やホスファチジルセリンに結合していない蛍光標識 Annexin V の蛍光を消去

• ホスファチジルセリンを Annexin V で蛍光検出
• プレートリーダーで測定可能(多検体処理)
• 洗浄操作が不要(バラつきや蛍光強度の低下の問題を解決)
• 別指標測定のキットと併用測定が可能

性質

正常な細胞では、細胞内に存在するホスファチジルセリン(PS)がアポトーシスの初期の段階で膜構造が変化し、細胞外へ露出します。本キットでは、ホスファチジルセリンと結合する Annexin V に蛍光色素である FITC を標識した試薬と Quenching Buffer を使用することで、洗浄操作が不要です。これまでプレートリーダーでの測定では、細胞死が誘導されるにつれ細胞が剥がれやすくなるため、洗浄操作によってバラつきや蛍光強度が低下する問題がありましたが、本キットではアポトーシス誘導に比例した結果を得ることができます。

また、本キットでは細胞サンプルを細胞と上清に分け、それぞれを異なる指標（試薬の併用）で測定することで、細胞死をより詳細に解析できます。

原理

アポトーシスは、細胞のプログラムされた死の一つであり、植物や動物のホメオスタシスや発生過程の維持に重要な役割を果たしています。その一つの例として、細胞生成過程で発生した異常な細胞はアポトーシスによって除去されます。アポトーシスの初期段階において、細胞膜の内側に存在するホスファチジルセリン (PS) が細胞膜の外側に移行することが知られています。この特異な変化により、アポトーシス細胞を識別することが可能です。
Annexin V は、カルシウムイオンの存在下でホスファチジルセリンに特異的に結合するタンパク質です。この特性を利用し、蛍光標識された Annexin V を用いることで、アポトーシス細胞を蛍光検出することが可能となります。一般的に、フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡を用いてアポトーシス細胞の検出が行われておりますが、多検体処理に時間を要します。
本キットには、蛍光標識 Annexin V や PS に結合していない蛍光標識 Annexin V の蛍光を消去する試薬 (Quenching Buffer) が同梱されており、洗浄操作不要でプレートリーダーで迅速に多検体検出が可能です。

フローサイトメトリー法との比較

HeLa 細胞を Staurosporine で処理し、アポトーシスを誘導しました。一方は、市販の FITC 標識 Annexin V で染色後にフローサイトメーターで蛍光検出し、もう一方は Annexin V Apoptosis Plate Assay Kit を用いてプレートリーダーで蛍光検出しました。その結果、フローサイトメーターとプレートリーダー両方でアポトーシスの進行に伴い蛍光強度の増加を確認しました。

＜実験条件＞

細胞種：HeLa 細胞
Staurosporine 濃度：5 µmol/L
時間：0～6 時間

＜検出条件＞

プレートリーダー：TECAN 社製 Infinite M200 PRO, ボトムリーディング
フローサイトメーター：SONY 社製 SA3800

Staurosporine 処理によりアポトーシス誘導した HepG2 細胞と通常細胞 (Control) のホスファチジルセリン、細胞外 LDH、細胞増殖の変化を解析しました。アポトーシスのマーカーとしてホスファチジルセリンを Annexin V Apoptosis Plate Assay Kit、死細胞の指標として細胞外の LDH を Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST、細胞増殖を Cell Counting Kit-8で測定しました。
その結果、Staurosporine 処理によってホスファチジルセリン、細胞外 LDH は増加し、細胞増殖は低下する結果が得られました。

＜実験操作＞

1. HepG2 細胞(2×10⁴ cell/well)を 96 well Black Plate (クリアボトム) に播種し、インキュベーター(37 ℃、5% CO₂ 存在下)で一晩培養した。
2. 培地を除去し、MEM 培地(Control)または MEM 培地で調製した5 μmol/L staurosporine 200 μLを添加し、インキュベーター(37 ℃、5% CO₂存在下)で 24 時間インキュベートした。
3. ①ホスファチジルセリン測定用ウェルから上清 100 µLを 96 well Clear Plate に移し、②細胞外 LDH を Cytotoxicity LDH Assay Kit の取扱説明書(ノンホモジニアスアッセイ)に従い測定した。
4. 96 well Black Plate の①ホスファチジルセリン測定用ウェルに working solution を60 μL 添加し遮光下室温で 15 分間静置した後、プレートリーダー(ボトムリーディング)で蛍光強度(Ex/Em = 488/525 nm)を測定し、得られた値からそれぞれブランクを差し引いて Annexin V - FITC 由来の蛍光強度を算出した。
5. 96 well Black Plate の③細胞増殖測定用ウェルから上清 100 μL を除いた後、Cell Counting Kit-8 の取扱説明書に従い測定した(2時間呈色反応し吸光度を測定)。

＜測定装置＞

TECAN 社製 Infinite M200 PRO