エクソソーム単離/精製キット

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ホスファチジルセリンとTim4 を用いた新規エクソソーム精製法

エクソソーム膜は分泌細胞由来のタンパク質や脂質を含んでいますが、その中でもホスファチジルセリン (PS) は、生細胞ではフリッパーゼという酵素の働きによって細胞膜の内側に配向しているのに対して、エクソソームでは膜の外側にも露出していることが知られています¹⁾ 。また、マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食受容体として知られるT-cell　immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4 (Tim4) タンパク質は、細胞外領域にあるIgV ドメインを介してカルシウムイオン依存的にPS と結合することがわかっています²⁾ 。

エクソソーム単離・精製手法の比較

※ 本比較表は当社独自調査によるものです。サンプル、検出対象および手法によって結果が変化いたしますので、各方法の性能を保証するものではございません。

PSアフィニティー法の性能データ

アプリケーションデータ	指標	実験手法	従来法との比較
			超遠心分離法	ポリマー沈殿法	抗体アフィニティー法
NanoSightによる粒子解析	粒子	Nanoparticle Tracking Analysis	✔	✔	-
ViewSizer3000による粒子解析	粒子	Nanoparticle Tracking Analysis	✔	-	-
電子顕微鏡による粒子解析	粒子	電子顕微鏡観察	✔	-	-
Tim4と抗エクソソームマーカー抗体のキャプチャー性能の比較	マーカータンパク質	ELISA	-	-	✔
ウエスタンブロッティングによる生体試料(血清・尿)から精製したエクソソームの解析	マーカータンパク質	ウエスタンブロッティング	✔	✔	✔
ウエスタンブロッティングによる回収量および純度比較	マーカータンパク質	ウエスタンブロッティング	✔	✔	-
microRNAおよびmRNAの回収量比較	microRNA/mRNA	リアルタイム定量PCR	✔	-	-
BCAアッセイによるエクソソームのタンパク質定量	総タンパク質	BCAアッセイ	-	-	-
プロテオミクス解析	プロテオミクス	LC/MS	✔	✔	-
リピドミクス解析	脂質量	LC/MS	✔	-	-
エクソソームの標識と細胞への添加試験	細胞の取り込み	蛍光顕微鏡観察、フローサイトメトリー	-	-	-

▼NanoSightによる粒子解析

[結果]
PSアフィニティー法は他の手法と比較して、エクソソームの粒径 (50～100 nm) に相当する粒子がより濃縮されており、純度が高いことが示された。

▼ViewSizer3000による粒子解析

[結果]
超遠心分離法では夾雑物も含んでいることが推測されるが、PSアフィニティー法では、100 nm 付近にシャープな分布が確認でき、高純度に精製されたエクソソームの粒子径と個数濃度の情報が得られた。

▼電子顕微鏡による粒子解析

電子顕微鏡は、電子線を用いて測定対象物の拡大像を得ることができる。電子線は電磁波として見た場合、非常に波長の短い波のため、光学顕微鏡よりはるかに高い倍率での形態観察が可能で、金属・高分子材料から生体組織・植物・食品等の含水物まで、あらゆる試料の観察・解析に使用されている。今回、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いてエクソソームの電子顕微鏡解析を行った。

[結果]
PSアフィニティー法は粒子数が多く、純度が高いエクソソームが単離できた。

▼Tim4と抗エクソソームマーカー抗体のキャプチャー性能の比較

9種類の細胞培養上清(10,000 x g 遠心処理)を用いて、サンプル中のエクソソームを Tim4 および各エクソソームマーカー抗体(CD9, CD63, CD81)で捕捉後、ビオチン標識抗エクソソームマーカー抗体を用いて測定した。

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[結果]
抗エクソソームマーカー抗体と比較して、Tim4は幅広い細胞種に由来するエクソソームを効率的に捕捉できた。

▼ウエスタンブロッティングによる生体試料(血清・尿)から精製したエクソソームの解析

＞ヒト血清

• ヒト血清サンプル 1 mL からPSアフィニティー法、超遠心分離法、抗体アフィニティー法によりエクソソームを回収し、ウエスタンブロッティング (抗CD9抗体、抗CD63抗体) により検出を行った。
  各レーンは150 μLの血清サンプルに相当する。精製したエクソソーム溶液 100 μLから15 μL抜き取り、4×SDSサンプルバッファーを5 μL添加し、全量アプライした。
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[結果]
PSアフィニティー法は、超遠心分離法や抗体アフィニティー法よりもエクソソームの回収量が多かった。

＞ヒト尿

• ヒト尿サンプル 1 mL からPSアフィニティー法、ポリマー沈殿法、超遠心分離法によりエクソソームを回収し、ウエスタンブロッティング (抗CD9 抗体) により検出を行った。
  各レーンは150 μLの尿サンプルに相当する。精製したエクソソーム溶液 100 μLから15 μL抜き取り、4×SDSサンプルバッファーを5 μL添加し、全量アプライした。
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[結果]
尿サンプルからもエクソソームを回収することができた。

＜参考＞ NanoSightによる粒子解析 (ヒト尿サンプル)

▼ウエスタンブロッティングによる回収量および純度比較

K562 細胞培養上清 (10% Exosome-depleted FBS 添加培地) からPSアフィニティー法、超遠心分離法、ポリマー沈殿法で回収したサンプルを電気泳動した後、銀染色およびウェスタンブロッティング (抗CD63 抗体、抗Flotillin-2 抗体、抗Lamp-1 抗体) により検出を行った。また、各回収画分をMS 解析し、同定した全ペプチドのうちK562 細胞に由来するヒトペプチドの割合を比較した。

<参考> MS解析により同定したヒト由来ペプチドの比較

[結果]
PSアフィニティー法はFBS添加培地からも高純度なエクソソームを回収することができた。

▼microRNAおよびmRNAの回収量比較

超遠心分離法とPSアフィニティー法で健常ヒト血清サンプルからエクソソームを単離した後、microRNA Extractor^® SP Kit (コードNo.295-71701) を用いてRNA を回収し、定量PCR 法によりmicroRNA 量 (let-7a，miR-16，miR-92a，miR-142-3p) およびmRNA 量 (GAPDH, PIK3CB) を測定し、Ct 値で比較した。

[結果]
超遠心分離法よりPSアフィニティー法で回収したエクソソームの方がより多くのmicroRNAおよびmRNAを回収できた。

▼BCAアッセイによるエクソソームのタンパク質定量

PSアフィニティー法を用いてCOLO201細胞培養上清から精製したエクソソームのタンパク質濃度を、Protein Assay BCA Kit (コードNo. 297-73101)の高感度プロトコールにより測定した。

• PSアフィニティー法で精製したエクソソーム溶液 25 μL を96 ウェルプレート上に分注し、Protein Assay BCA Kit 付属の試薬 A と試薬 B の混合液を 200 μL 添加した。その後、60℃で 30 分間インキュベーションし、560 nm の吸光度を測定した。
  

  細胞培養上清(5倍濃縮) 10 mLから精製したエクソソームタンパク質濃度
  吸光度(ーBLANK) = 0.1152
  タンパク質濃度 = 49.2 μg/mL

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[結果]
Protein Assay BCA Kit の高感度プロトコールで、精製エクソソームのタンパク質濃度を測定できた。
* エクソソームのタンパク質濃度は非常に低いため、BCAアッセイの場合はサンプルを希釈せずに測定してください。

▼プロテオミクス解析

PS アフィニティー法、超遠心分離法、ポリマー沈殿法を用いて、K562 細胞培養上清 (10% Exosome-depleted FBS 添加培地) からエクソソームを精製した。精製したサンプルを10% ポリアクリルアミド電気泳動で分離し、タンパク質バンド全体を切り出した。その後、ゲル内消化を行い、LC-MS でタンパク質を同定した。また、各手法で精製したエクソソーム (n=3) における同定タンパク質のpair-wise相関を比較した³⁾。

①同定したタンパク質の含有量トップ10 比較

②Pair-wise相関の比較

▼リピドミクス解析による超遠心分離法との脂質量の比較

COLO201細胞培養上清よりPSアフィニティー法もしくは超遠心分離法でEVを単離・精製した。その後、EV溶液中のタンパク質濃度を揃えた条件でリピドミクス解析を実施し、脂質クラス別の定量値を比較した。なおPSアフィニティー法で単離したEVはブロッキング試薬であるEV-Save™ 細胞外小胞ブロッキング試薬 (コードNo. 058-09261, 以下、EV-Save™) を添加し、脂質の定量に与える影響を調べた。

＜サンプル条件＞

PSアフィニティー法

COLO201細胞培養上清 5 mLを限外ろ過で1 mLまで濃縮し、PSアフィニティー法でEVを単離・精製した。

超遠心分離法

COLO201細胞培養上清 25 mLについて超遠心分離 ([100,000×g、70分]×2) を行い、ペレットをバッファーに溶解した。

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• ※ 本実験ではホスファチジン酸 (PA) およびホスファチジルグリセロール (PG) は検出できなかった。

リピドミクス解析による超遠心分離法との脂質量の比較
縦軸はブランクの値を差し引いたタンパク質1 mgあたりの脂質量 (pmol/mg protein)

[結果]
PSアフィニティー法は、測定したすべての脂質において超遠心分離法よりも得られた脂質量が多かった。またEV-Save™を添加することで、ほとんどの脂質でEV-Save™未添加よりも脂質の測定値が増加した。

▼エクソソームの標識と細胞への添加試験

PSアフィニティー法で精製したエクソソームを PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit (Sigma-Aldrich社)で標識し、HeLa 細胞の取り込み能を確認した。

＜PKH67 を用いたエクソソーム標識＞

1. PSアフィニティー法でCOLO201 細胞培養上清からエクソソームを精製する^*1。
2. BCAアッセイ および NanoSight を用いてエクソソーム溶液のタンパク質濃度と粒子濃度を測定する。
3. 1.5 mL チューブにエクソソーム溶液を分注する^*2。
4. 2.0 μL の PKH67 linker を 0.25 mL の Diluent C (PKH67 キット添付) に溶解させる・・・ 4 x Dye solution^*3
5. サンプルに対して 1/3 量の 4 x Dye solution を添加し、混合後に室温で 5 - 10 分間インキュベーションする。
6. Exosome Spin Columns (MW 3000) (Thermo Fisher Scientific社) を添付プロトコルに沿って PBS で平衡化する。
7. 上記平衡化済みカラムに 100 μL ずつサンプルをそれぞれ添加し^*4、750 x g、2 分間遠心する。
8. 前日ディッシュに播種しておいたHeLa細胞に溶液を全量添加^*5し、24 時間後に顕微鏡観察およびフローサイトメトリー解析を実施する。

 *1 キット添付の溶出液にEV-Save^TM 細胞外小胞ブロッキング試薬 (コードNo. 058-09261)を加えると、工程7 のゲル濾過処理時で標識サンプルの吸着ロスを抑制することができます。
 *2 タンパク質量で3 μg、粒子数 1 x 10¹⁰個相当のエクソソームを使用しましたが、標識に必要なエクソソーム量は適宜調節してください。
 *3 標識に必要な量を適宜調製してください。
 *4 カラム一本への最大添加量は100 μL のため、サンプル量が100 μL 以上の場合は必要本数用意してください。
 *5 添加するエクソソーム量を適宜調節してください。

• 顕微鏡観察

  

• フローサイトメトリー解析

  

[結果]
PKH67標識されたエクソソームがエンドサイトーシスで取り込まれていることが、顕微鏡でもフローサイトメーターでも確認できた。 また、EV-Save^TM を添加したサンプルは、Dye を除去する時のゲルろ過カラムへの吸着ロスを抑制した。

参考文献

1. Trajkovic, K. et al.: Science, 319(5867), 1244(2008).
   Ceramide triggers budding of exosome vesicles into multivesicular endosomes
2. Miyanishi, M. et al.: Nature, 450(7168), 435(2007).
   Identification of Tim4 as a phosphatidylserine receptor
3. Nakai, W. et al.: Rep. 6(1), 33935(2016).
   A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles