制限酵素/修飾酵素

制限酵素は2本鎖DNAの特定の塩基配列を認識し、これを切断する働きを持っています。制限酵素の利用によりDNAの解析や遺伝子組み換えが可能になり、生命科学研究は大きく進展しました。制限酵素はその種類により切断する配列が異なります。当社では、種々の遺伝子配列に対応した制限酵素を幅広く取り揃えています。

製品ラインアップ

学術コンテンツ

遺伝子のクローニングや構造・機能解析では核酸の切断、修飾、分解などの操作が必要になります。核酸の切断は制限酵素、修飾は脱りん酸化/りん酸化酵素、分解は核酸分解酵素などの酵素が使用されています。それぞれの酵素の概要と特長を下記にまとめました。

制限酵素

制限酵素は二本鎖DNAの特定の配列(認識配列)を認識し、切断する酵素です。クローニングにおいてベクターの挿入に必要なDNA断片の作成などに使用されます。制限酵素はもともとバクテリアがファージなどの感染から自身を守るために外来DNAを切断する役割があります。(自身のDNAには修飾を加え、制限酵素による切断を防いでいます)。

制限酵素は切断様式や反応に必要な要素の違いで、タイプI~IVに分けることができます。

タイプ I

3種類の異なるサブユニット(配列認識、エンドヌクレアーゼ、メチルトランスフェラーゼ)から構成される制限酵素です。切断部位は認識配列から1kbp以上離れており、一定ではありません。反応にはS-アデノシルメチオニン(SAM)やATPが必要となります。

タイプ II

配列認識およびエンドヌクレアーゼ活性をもつ制限酵素です。修飾活性はもちません。認識部位(もしくはその近傍)を正確に切断する為、クローニングなどには主にタイプIIの制限酵素が用いられます。反応にはMg²⁺が必要です。

タイプ III

2つのサブユニットから構成される制限酵素です。切断部位は認識配列から25~28bpほど離れています。反応にはATP、Mg²⁺が必要です。

タイプ IV

メチル化、ヒドロキシメチル化、グルコシルヒドロキシメチル化されたDNAを切断する制限酵素で、認識部位と切断部位は離れています。

制限酵素は特有の認識配列を持ち、その多くが回文(パリンドローム)構造です(図1)。別々の制限酵素でも同じ配列を認識する場合、これらの制限酵素はイソシジマーと呼ばれ、同じ認識配列でも切断様式が違う場合にはネオシジマーと呼ばれます。

また制限酵素は認識配列だけでなく、切断様式も種類によって異なり、それによって生じる末端の構造は粘着性末端(5'突出末端、3'突出末端)と平滑末端に大別されます。一般的に粘着性末端は、平滑末端に比べ、その後のライゲーション効率が高いとされています。

制限酵素反応は通常37℃で行われます。制限酵素によって反応に最適な塩濃度は異なるので、それぞれの制限酵素に適したバッファーを選択する必要があります。ニッポンジーンの制限酵素は、バッファー条件を始め、各種切断条件や分類を遺伝子工学用試薬カタログにて詳しく記載しています。

修飾酵素

酵素による核酸の修飾には脱りん酸化やりん酸化などがあります。

二本鎖DNAのライゲーション反応は5'りん酸基末端と3'水酸基末端を結合する反応であり、りん酸化や脱りん酸化はライゲーション反応の前処理で重要な役割を果たします。プラスミドベクターのセルフライゲーションを防ぐためには、ベクターの5'末端を脱りん酸化することが有効です。脱りん酸化にはバクテリア由来のアルカリフォスファターゼ(BAP)や仔牛小腸由来のアルカリフォスファターゼ(CIP)が良く使用されます。一方、5'末端がりん酸化されていない断片をライゲーションに使用する場合は、DNA断片のりん酸化が必要です。りん酸化酵素としてファージ由来のT4ポリヌクレオチドキナーゼが使用されています。

核酸分解酵素

核酸分解酵素は、核酸を加水分解する酵素です。DNAとRNAの両方を分解するものをヌクレアーゼといい、末端から分解していくものをエキソヌクレアーゼ、核酸の内部から切断するものをエンドヌクレアーゼと言います。制限酵素もエンドヌクレアーゼの一種です。さらにDNAのみ分解するものをDNase、RNAのみ分解するものをRNaseといいます。核酸分解酵素は核酸抽出におけるDNAやRNAの除去、DNA断片の平滑化、DNA/RNAの構造や相互作用の解析などに使用されます。
下記に代表的なヌクレアーゼとその特長・用途をまとめました。

ヌクレアーゼ	切断核酸	一本鎖	二本鎖	特長	用途
DNase I	DNA	〇	〇	Mg²⁺存在下でランダムに切断。	DNAの除去、DNaseフットプリント解析など。
RNase A	RNA	〇	×	ピリミジン塩基の3'末端にあるホスホジエステル結合を切断。	RNAの除去など。
RNase H	RNA	×	〇	DNA-RNAハイブリッド鎖のRNAを分解。	逆転写反応後の鋳型RNAの分解など。
Nuclease P₁	DNA RNA	〇	×	二本鎖核酸の一本鎖にも作用する。Zn²⁺存在下で切断。	一本鎖DNAの選択的分解、DNA末端の平滑化など。
Nuclease S₁	DNA RNA	〇	×	二本鎖核酸の一本鎖にも作用する。Zn²⁺存在下で切断。	一本鎖DNAの選択的分解、DNA末端の平滑化、S₁マッピングなど。
Mung Bean Nuclease	DNA RNA	〇	×	二本鎖核酸の一本鎖にも作用する。Nuclease S₁よりも末端が揃いやすい。	一本鎖DNAの選択的分解、DNA末端の平滑化など。

参考文献

Roberts, R. J. et al. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. Nucleic Acids Res. 31, 1805-1812 (2003). 今川和友, 山川民夫監修, 生化学辞典 (第4版), 東京化学同仁, 2007
田村隆明編, 改訂第3版遺伝子工学実験ノート(上), 羊土社, 2010
Michel R. Green and Joseph Sambrook, "Molecular Cloning", A Laboratory Manual, 4th ed. (2012).