アフィニティータグ

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アフィニティータグとは?

アフィニティータグは、目的のタンパク質に付加する短いポリペプチドやタンパク質です。エピトープタグとも呼ばれます。目的タンパク質に対する抗体が存在しない場合でも、アフィニティータグを認識する抗体があれば、目的タンパク質の検出や精製を行うことができます。一般的にアフィニティータグは目的タンパク質をコードする遺伝子配列の前後もしくは内部に、タグの遺伝子配列を挿入することで付加されます。

• 長所

  • 目的タンパク質に対する抗体が存在しない場合でも、目的タンパク質の検出や精製を行うことができる。
  • 内在性のタンパク質と区別ができる。
  • タグを検出するため、目的タンパク質に類似のタンパク質と交差反応しない。
  • タンパク質の可溶性を向上させることができる。(アフィニティータグの種類による)

• 短所

  • アフィニティータグの付加により、目的タンパク質の立体構造や活性が変わる可能性がある。
  • 遺伝子工学によるアフィニティータグ配列の挿入が必要となる。
  • プラスミドなどで発現させた場合、内在性のタンパク質と比較して過剰発現となる。

アフィニティータグ 比較表

主要なアフィニティータグについて、その特性および長所・短所をまとめました。

アフィニティータグ	PA	DYKDDDDK (FLAG®)※1	6×His	HA
由来	ヒト ポドプラニン	人工配列	人工配列	インフルエンザウイルス ヘマグルニチン
配列	GVAMPGAEDDVV	DYKDDDDK	HHHHHH	YPYDVPDYA
残基数	12	8	6	9
分子量(kDa)	1.2	1.0	0.8	1.1
抗体結合力※2 (Kd(M))	4.9×10-10	2.8×10-8	1.0×10-5~6	2.8×10-9
溶出方法	ペプチド競合溶出 酸溶出	ペプチド競合溶出 酸溶出	イミダゾール競合溶出 キレート剤溶出など	ペプチド競合溶出 酸溶出
レジン再利用法	3M MgCl2 + MES(pH6.0)	Tris-HCl + Glycine Buffer(pH2~3.5)	0.5M Imidazole(pH7.4)	Tris-HCl + Glycine Buffer(pH2~3.5)
長所	タグと抗体の親和性が非常に高い タグと抗体の特異性が高い (対DYKDDDDK※2) 中性条件でレジンの再生が可能 抗体がタグのループ構造を認識できるため膜タンパク質への挿入も可能	親水性なので融合タンパク質の表面付近に存在しやすい 3×FLAGは100 fmolのタンパク質を検出可能 抗体はほとんどの哺乳動物細胞および細菌細胞のライセートで交差しない エンテロキナーゼによって切断できる	尿素やグアニジン塩酸塩で変性させたタンパク質の精製も可能 タグが小さいために組換えタンパク質に対する影響が少ない 比較的低コスト 担体に結合させたまま、リフォールディングが可能	タグが小さいために組換えタンパク質に対する影響が少ない 親水性なので融合タンパク質の表面付近に存在しやすい
短所	ヒトポドプラニン発現細胞(HEK293, COS-7)では内在性のポドプラニンが検出される	比較的高コスト	宿主のヒスチジン残基リッチな領域と非特異的に吸着する 還元剤、酸化剤、キレート剤を含むサンプルには使用不可	アポトーシスで活性化されるカスパーゼ3/7により切断され、免疫反応性を失う※3

アフィニティータグ	V5	c-Myc	GFP	GST	MBP
由来	シミアンウイルス V protein	ヒト c-Myc	オワンクラゲ GFP	日本住血吸虫 Glutathione-S-transferase	大腸菌 Maltose Binding Protein
配列	GKPIPNPLLGLDST	EQKLISEEDL	-	-	-
残基数	14	10	238	218	370
分子量(kDa)	1.4	1.2	27.0	26.0	43.0
抗体結合力※2 (Kd(M))	-	2.2×10-9	-	1.0×10-5~6	-
溶出方法	ペプチド競合溶出 酸溶出	ペプチド競合溶出 酸溶出	酸溶出	Glutathione競合溶出	Maltose競合溶出
レジン再利用法	Tris-HCl + Glycine Buffer(pH2~3.5)	Tris-HCl + Glycine Buffer(pH2~3.5)	-	Glutathione,Tris-HCl + Glycine Buffer(pH2~3.5)	-
長所	タグが小さいために組換えタンパク質に対する影響が少ない	タグが小さいために組換えタンパク質に対する影響が少ない 親水性なので融合タンパク質の表面付近に存在しやすい	GFPの蛍光を観察することも可能	発現タンパク質の可溶性が増加する 酵素・基質反応であるため、特異性が高い (Glutathioneをリガンドとした場合)	マルトースとの競合溶出となるため、非常に穏和な条件で精製 発現タンパク質の可溶性が増加する
短所		内在性c-Mycも検出する	分子量が大きく、タンパク質の構造・機能を阻害する可能性がある 変性条件下では抗体がタグを認識できず、精製ができない	分子量が大きく、タンパク質の構造・機能を阻害する可能性がある 変性条件下では抗体がタグを認識できず、精製ができない	分子量が大きく、タンパク質の構造・機能を阻害する可能性がある 変性条件下では抗体がタグを認識できず、精製ができない

• 1 FLAG^®はSigma-Aldrich社の登録商標です。
• 2 当社独自調査によるもので、各アフィニティータグの性能を保証するものではありません。
• 3 Schembri, Laura, et al. "The HA tag is cleaved and loses immunoreactivity during apoptosis." Nature methods 4.2 (2007): 107-108.

参考文献

Jarvik, Jonathan W., and Cheryl A. Telmer. : "Epitope tagging.", Annual review of genetics, 32.1 (1998): 601-618.
武縄忠臣 編, タンパク質実験ハンドブック, 羊土社, 2003
岡田雅人 宮崎香 編, 改訂第4版 タンパク質実験ノート 上 タンパク質をとり出そう (抽出・精製・発現編), 羊土社, 2011
永田恭介 奥脇暢 編, 目的別で選べるタンパク質発現プロトコール, 羊土社, 2013