蛍光色素

蛍光色素は光エネルギーを吸収して励起状態になります。励起できる波長は蛍光色素によって異なるため、複数の蛍光色素を使用する系でも一方の蛍光色素のみ励起させることが可能です。

励起状態の蛍光色素は非常に不安定であるため、すぐに基底状態に戻ります。この時、吸収したエネルギーを光エネルギーとして放出することで蛍光を発します。蛍光を発しない分子は吸収したエネルギーの多くを熱エネルギーなどで放出してしまうため、蛍光は観察できません (図1)。

実験の目的に合った蛍光色素を選択するには下記の特性を考慮する必要があります。

励起波長・蛍光波長

蛍光色素には色素固有の最大励起波長と最大蛍光波長があります。励起光による細胞や生体分子へのダメージをできるだけ低減するため、最大励起波長が長波長の蛍光色素を選択することが理想です。また短波長である紫外光は、細胞にもともと存在する蛍光物質を励起する可能性も高いので、この点からも長波長の励起光を選択することが望ましいとされています。

励起スペクトルの極大波長と蛍光スペクトルの極大波長の差をストークスシフトと呼びます。蛍光色素のストークスシフトが小さいと、蛍光色素が発した蛍光と励起光の分離が困難であるため、通常、ストークスシフトの大きい蛍光色素が使用されます (図2)。

光褪色

励起により生じた活性酸素種が蛍光色素の酸化的分解を引き起こしたりすると蛍光色素の褪色が生じます。ライフサイエンス分野のイメージングに使用される蛍光色素ではフルオレセインやシアニン系色素は褪色しやすく、ローダミン系色素が褪色に強いと言われています。実際、Janelia Fluor Dyeと呼ばれるテトラメチルローダミンベースの蛍光色素は優れた光安定性を示します。