【クロマトQ&A】：PTC誘導体化アミノ酸分析法における、アミノ酸混合標準液成分以外のアミノ酸分析
本記事は、Analytical Circle No.75（2014年12月号）に掲載されたものです。
HPLC法による遊離アミノ酸の分析法として過去のクロマトQ&A(No.60（2011年3月号）、No.72（2014年3月号）に掲載)にPTC誘導体化法が紹介されていますが、アミノ酸混合標準液H型の混合成分以外のアミノ酸も分析することが可能でしょうか。
アミノ基を持つ化合物のPTC化が可能です。
PTC(フェニルチオカルバモイル)化は、フェニルイソチオシアナート(PITC)試薬(コードNo.162-08473)を用いて誘導体化する方法で、一級アミンおよび二級アミンに反応します。誘導体化した化合物の分子吸光係数がどのアミノ酸もほとんど同じであるという特長を有しています。多成分のアミノ酸の同時分析にはグラジエント溶出が必要になりますが、Wakopak®Wakosil-PTCと専用溶離液を使用することで簡便に再現性の良いアミノ酸の分離分析が可能です。
アミノ酸混合標準液H(コードNo.019-08393)の混合成分以外のアミノ酸についても代表的なアミノ酸については、誘導体化してWakopak®Wakosil-PTCと専用溶離液を用いて分析した際の溶出位置を確認しています。
フェニルアラニンの保持時間を１とした時の各アミノ酸の相対保持時間を表1にまとめて示しました。
HPLCで汎用的に使用されている紫外吸収検出器(UV検出器)で、1 pmolまでの高感度分析が可能であることも特長の一つで、食品中や生体試料中などの遊離アミノ酸、およびタンパク質やペプチドなどから塩酸加水分解などの方法により遊離したアミノ酸を誘導体化することで、試料中のアミノ酸組成分析が簡便に実施できます。
Table 1. Relative retention times for PTC derivatives of amino acids
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No. Amino acid R.t.(※) 1 Cysteic acid 0.191 2 Phosphoserine 0.204 3 Aspartic acid 0.226 4 Glutamic acid 0.259 5 Carboxymethyl cysteine 0.299 6 α-Aminoadipic acid 0.356 7 Hydoroxyproline 0.362 8 Asparagine 0.461 9 Galactosamine 0.466 10 Serine 0.482 11 Glucosamine 0.483 12 Glutamine 0.493 13 Glycine 0.512 14 Homoserine 0.526 15 Histidine 0.542 16 β-Alanine 0.545 17 Citruline 0.552 18 Carnosine 0.574 19 Methionine sulfoxide 1 0.577 20 Taurine 0.577 21 Arginine 0.583 22 Methionine sulfoxide 2 0.586 23 γ-Amino butyric acid 0.601 -
No. Amino acid R.t.(※) 24 Threonine 0.601 25 1-Methyl histidine 0.606 26 3-Methyl histidine 0.611 27 Alanine 0.620 28 β-Amino butyric acid 0.635 29 Proline 0.635 30 Methionine sulfone 0.664 31 Ammonia 0.676 32 α-Amino butyric acid 0.722 33 Tyrosine 0.777 34 Valine 0.824 35 Methionine 0.854 36 Cysteine 0.883 37 Isoleucine 0.933 38 Leucine 0.945 39 Norleucine 0.967 40 Nitrotyrosine 0.987 41 Phenylalanine 1.000 42 Tryptophan 1.017 43 Ornithine 1.020 44 Lysine 1.063 45 Reagent 1.080 46 N-Methyllysine 1.100
水色行：タンパク質構成アミノ酸
緑色行：試料、試薬由来成分
赤色行：(コードNo.019-08363) Amino Acids Standard Solution Type Hの合成19成分
※Phenylalanineの保持時間を基準にして算出した相対保持時間。
Column : Wakopak®Wakosil-PTC 4.0 mm x 250 mm
Flow rate : 1.0 mL/min. at 40℃
Gradient : B conc. 0-70 % (20 min)
Detection : UV 254nm
●Wakosil-PTC文献：井上逸男，福本昌巳，上森仁志，佐方由嗣，庄司省三，久保田幸穂：生化学，61，1012（1989）.