エクソソームをはじめとする細胞外小胞の大量精製用カラム

MassivEV™ EV Purification Column PS / MassivEV™ Purification Buffer Set

エクソソームに代表される細胞外小胞(EV: Extracellular Vesicles)は細胞が放出する脂質二重膜の微小な小胞で、核酸・タンパク質・脂質などを内包しています。生体では細胞間のコミュニケーションツールとして利用されており、免疫をはじめ、がん・神経・代謝など様々な分野で研究が盛んに行われています。

EVの応用分野は幅広く、治療薬やバイオマーカー、ドラッグデリバリーシステム(DDS)への応用が期待されています。特に間葉系幹細胞(MSC: Mesenchymal stem cell)が分泌するEVは抗炎症や抗線維化、組織修復などの作用があることが報告され1)、医療に限らず化粧品や食品などの分野においても注目が集まっています。

EVの実用化には、高純度なEVを効率良く大量に単離・精製できる技術が必要です。当社では金沢大学医学系免疫学の華山教授と共同開発した、独自のEV単離・精製技術である「PSアフィニティー法」2)を応用し、EVの大量精製用カラム MassivEV™ EV Purification Column PSを開発しました。専用バッファーのMassivEV™ Purification Buffer Setと合わせて用いることで、リッタースケールの細胞培養上清から、エクソソームなどのEVを簡便に単離・精製することができます。

  • MassivEV™ EV Purification Column PS

    MassivEV™ EV Purification Column PS

  • MassivEV™ Purification Buffer Set

    MassivEV™ Purification Buffer Set

製品概要

MassivEV™ EV Purification Column PSおよびMassivEV™ Purification Buffer Setは大容量の細胞培養上清からエクソソームなどの細胞外小胞(EV)を単離・精製するためのカラムとその専用バッファーです。EVの膜表面に存在するホスファチジルセリン(PS)に対してカルシウム依存的に結合するTim4タンパク質を使用した「PSアフィニティー法」によって高純度なEVを簡便に精製できます。

特長

  • 大容量(10 mL~Lスケール)の細胞培養上清から高純度なEVを効率良く単離・精製可能
  • タンジェンシャルフローろ過(TFF)システムのような高価な装置は不要 ※ 別途ペリスタポンプが必要となります

表1 間葉系幹細胞の細胞培養上清 200 mLからEVを単離・精製した場合の比較表 (当社調べ)

MassivEV™ TFF+陰イオン交換クロマトグラフィー TFF+サイズ排除クロマトグラフィー
精製できるEV PS陽性EV フラクションにより異なる フラクションにより異なる
純度 高い 低い 低い
精製段階の工程数 1工程
∟PSアフィニティー法
2工程
∟TFFシステム
∟陰イオン交換クロマトグラフィー
2工程
∟TFFシステム
∟サイズ排除クロマトグラフィー
回収したEV粒子数 (参考値) 1.7x1011 particles 1.1×1011 particles 0.7×1011 particles
精製段階にかかる時間 8時間 10時間 10時間
<参考> マウス1匹に対するEV投与量の目安3-5): 1.0x109 particles/mouse

適応

細胞培養上清(MSCなど): 10 mL~ L スケール

※ 10 mL以下の細胞培養上清からEVを単離する場合は、MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2 (コードNo. 290-84103)をご使用ください。

処理能力

1 mL (コードNo. 131-19491) 5 mL (コードNo. 137-19493)
処理サンプル量※1 200 mL 1 L
動的結合容量※2 5×1011 particles/mLレジン 2.5×1012 particles/5 mLレジン
※1 MSCの細胞培養上清において、1回の精製で処理できるサンプル量の目安です。処理サンプル量は、細胞培養上清に含まれるEVの粒子数によって変化します。 なお同一サンプルの場合、カラムは繰り返し使用することができ、当社では5回(通常使用1回、繰り返し使用4回)まで使用できることを確認しています。
※2 MSC由来EVを用いた検討結果です。細胞種など条件によって変化する可能性がございます。

原理

PSアフィニティー法は、EVの表面に存在するホスファチジルセリン(PS)と特異的に結合するTim4タンパク質を利用した当社独自のEV単離手法です。
PS-Tim4結合の高い特異性とキレート剤によるマイルドな溶出で高純度なEVをインタクトな状態で単離できます。

  • 結合

    図1 MassivEV™ EV Purification Column PS (PSアフィニティー法)による細胞外小胞の単離・精製の原理
  • 溶出

    図1 MassivEV™ EV Purification Column PS (PSアフィニティー法)による細胞外小胞の単離・精製の原理

図1 MassivEV™ EV Purification Column PS (PSアフィニティー法)による細胞外小胞の単離・精製の原理

プロトコル

培養
Step
01
細胞培養
任意の細胞を培養し、細胞増殖とEV産生を行い、細胞培養上清を回収する。
準備
(>2時間)
Step
02
サンプル準備
細胞培養上清にEV Binding Enhancerを添加する。
Step
03
細胞培養上清の前処理
遠心分離もしくはフィルターによって夾雑物を除去する。
Step
04
脱気
室温以上の温度(25-28℃)になるように細胞培養上清を加温し、フィルターでろ過する。
カラム処理
(>7時間)
Step
05
洗浄1
カラムを室温に戻し、Washing Bufferをカラムに流す。
Step
06
サンプル反応
細胞培養上清をカラムに流し、EVのPSとレジンのTim4タンパク質を反応させる。
Step
07
洗浄2
EV Binding Enhancer/Washing Bufferをカラムに流し、レジンを洗浄する。
Step
08
溶出
EV Elution/EV-Stabilizer Bufferでカラム内のEV Binding Enhancer/Washing Bufferを50%置換する。
その後、EV回収用チューブをセットし、EV Elution/EV-Stabilizer Bufferを流してEVを回収する。
Step
09
カラム保存
Washing Bufferを流した後、20%エタノール/Storage Bufferを流す。カラム上部にパラフィルムを巻いて冷蔵(2-10℃)で保存する。
置換
(30分~ 1時間)
Step
10
バッファー交換
ゲルろ過もしくは限外ろ過によってバッファー交換を行う。

【プロトコル】 MassivEV™ EV Purification Column PSを用いた細胞外小胞の大量精製
(Youtube 3:26)

データ

性能データ

従来法との比較

骨髄由来MSCを増殖培地(MSCulture™/ 10% FBS)およびEV産生培地(EV-Up™)で培養し、細胞培養上清を回収後、0.22 μmのフィルターでろ過した。ろ過処理後の細胞培養上清 200 mLをサンプルとして、以下4つの方法でEVを単離・精製した。また精製後のEV溶液はNanoparticle Tracking Analysis (NTA)、ELISA、BCA法にてそれぞれ解析した。

<単離手法>

MassivEV™
MassivEV™ EV Purification Column PS / MassivEV™ Purification Buffer Set (本製品, PSアフィニティー法)
TFF
タンデンシャルフローろ過(500 kDa)のみ
TFF+AEX
タンデンシャルフローろ過(500 kDa)+陰イオン交換クロマトグラフィー
TFF+SEC
タンデンシャルフローろ過(500 kDa)+サイズ排除クロマトグラフィー

(1) NTAによる粒子解析

(1) NTAによる粒子解析
(1) NTAによる粒子解析

[結果]
MassivEV™はTFFと比較して粒子数は少ないものの、TFF+AEXやTFF+SECと比較して多くの粒子を得ることができた。

(2) CD63 ELISAおよびCD81 ELISAによるEV回収率の比較(n=3)

(2) CD63およびCD81 ELISAによるEVの回収率 (n=3)
(2) CD63およびCD81 ELISAによるEVの回収率 (n=3)

[結果]
MassivEV™は従来法と比較して高いEV回収率を示した。

(3) タンパク質 1μgあたりの粒子数

EVの純度を示す指標の1つとして、タンパク質あたりの粒子数が有効であることが報告されている6)。回収したEV溶液の総タンパク質量をBCA法で、粒子数をNTAでそれぞれ測定し、タンパク質 1μgあたりの粒子数を比較した。

(3) タンパク質 1μgあたりの粒子数

[結果]
MassivEV™は従来法と比較してタンパク質 1μgあたりの粒子数が多く、より純度の高いEVが回収できていることが示唆された。

ライセンスについて

本製品は研究用途でご使用ください。営利・商業目的にご使用される場合には、当社(ffwk-labchem-tec@fujifilm.com)までお問い合わせください。

参考文献

製品一覧

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MassivEV™ Purification Buffer Setと合わせてご使用ください

MassivEV™ EV Purification Column PSと合わせてご使用ください

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