Exosome 抽出・精製試薬

ホスファチジルセリンとTim4 を用いた新規エクソソーム精製法

エクソソーム膜は分泌細胞由来のタンパク質や脂質を含んでいますが、その中でもホスファチジルセリン(PS)は生細胞ではフリッパーゼという酵素の働きによって細胞膜の内側に配向しているのに対して、エクソソームでは膜の外側にも露出していることが知られています3)。また、マクロファージによるアポトーシス細胞の貪食受容体として知られる T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4(Tim4)タンパク質は、細胞外領域にある IgV ドメインを介してカルシウムイオン依存的に PS と結合することがわかっています4)

以上の知見をもとに、当社はTim4 を固相化した磁気ビーズを用い、カルシウムイオン存在下で培養上清や血清などのサンプル中のエクソソームを捕捉し、キレート剤を添加することによってエクソソームを精製することができる、既存の手法とは一線を画す新たなエクソソーム精製法を金沢大学医学系免疫学の華山教授と共同で開発し、キット化に成功しました5)

なお、このエクソソーム精製キットである MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS は、従来のエクソソーム精製法よりも高純度なエクソソームをインタクトな状態で簡便に精製することを実現しており、これまでゴールドスタンダードとされてきた超遠心法に置き換わる新たなエクソソーム精製法として確立されつつあります。

膜表面のホスファチジルセリン(PS)に対するアフィニティー法

ホスファチジルセリン(PS)結合分子を用いて細胞外小胞を金属イオン依存的に捕捉した後、キレート剤により溶出します。

参考文献
  1. Tkach, M. et al. Communication by Extracellular Vesicles : Where We Are and Where We Need to Go. Cell 164, 1226-1232(2016).
  2. Raimondo, F. et al. Advances in membranous vesicle and exosome proteomics improving biological understanding and biomarker discovery. Proteomics 11, 709-720(2011).
  3. Trajkovic, K. et al. Ceramide triggers budding of exosome vesicles into multivesicular endosomes. Science 319(5867) : 1244-7(2008).
  4. Miyanishi, M. et al. Identification of Tim4 as a phosphatidylserine receptor. Nature 450, 435-439(2007).
  5. Nakai, W. et al. A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles. Sci. Rep. 6, 33935(2016).

MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS 特長

  • 新規アフィニティー精製法採用

    • PSアフィニティー分子による回収
    • 低バックグラウンド
    • キレート剤により中性条件下でマイルドに溶出

    ※抗体による従来アフィニティー精製法よりもエクソソームが 高収量であることを確認しています。

    高純度・インタクトエクソソームを単離

  • 超遠心分離不要

    • マグネティックビーズによる操作性アップ
    • 最適化されたプロトコール

    高い実験再現性

他の精製方法との比較
方法 純度 エクソソーム回収量 インタクト粒子の取得 総タンパク量
MagCapture™ (PSアフィニティー法) ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■
超遠心分離法 ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■
ポリマー沈殿法 ■ ■ ■ ■ ■ ■
密度勾配遠心分離法 ■ ■ ■ ■ ■
サイズ分画法 ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■
表面抗原アフィニティー法(抗体使用) ■ ■ ■ ■ ■ × No data

※本比較表は当社独自調査によるものです。サンプル、検出対象および手法によって結果が変化いたしますので、各方法の性能を保証するものではございません。

対象サンプル:細胞培養上清、血清、血漿、尿など

 

各種サンプルの前処理プロトコール

本工程はサンプルの前処理ステップです。エクソソームとその他の細胞外小胞(マイクロベジクルなど)を回収したい場合は下記プロトコールに従い1,200 x g 遠心分離上清画分※ 1 を調製してください。またエクソソームをより高純度に回収したい場合は下記プロトコールに従い10,000 x g 遠心分離上清画分※ 2 を調製してください。

下記では、細胞培養上清および血清・血漿サンプルを用いる場合の前処理フローを記載しています。その他の体液サンプルを用いる場合は血清・血漿サンプルのプロトコールを参考に、適宜前処理プロトコールをご検討ください。

※1 エクソソーム+Large EVsを回収したい場合、1,200 x g上清を精製用サンプルとして使用してください。
※2 エクソソームを回収したい場合、10,000 x g上清を精製用サンプルとして使用してください。
※3 Large EVsを回収したい場合、10,000 x gで遠心分離して得られる「沈殿」をTBSに懸濁してサンプルとして使用してください。

※4 濃縮ステップは大容量(~50 mL)の細胞培養上清を精製用サンプルとして使用する場合のオプションですが、回収効率が向上するため、可能な限り実施してください。
※5 EV-Save™はポリマーを含むため、プロテオミクス解析用サンプルへの使用は推奨しません。

多量または少量サンプルの場合の注意点

多量サンプルの場合

大容量(〜50 mL)の細胞培養上清から精製する場合に濃縮作業をオプションで推奨しています。回収効率が向上するため、可能な限り実施してください。

少量サンプルの場合

サンプル容量が0.5 mL 未満の場合、Exosome Capture 固定化ビーズとサンプルがローテーターにより上手く撹拌できない場合があるため、必要に応じてTBS Bufferを添加してサンプル量を0.5 mL 以上にスケールアップしてください(例:100 〜200 μL → 500 μL)。

参考データ:エクソソームとLarge EVs のNTA 解析

モネンシンナトリウムでエクソソーム分泌を亢進させたK562 培養上清 1 mL を用意し、そこから10,000 x g 遠心分離上清画分サンプルおよび10,000 x g 沈殿サンプル(TBS 1 mL で懸濁)を調製した。

続いて、両サンプルからMagCapture™ Exosome Isolation Kit PS で細胞外小胞を精製し、NanoSight LM10 により解析した。

MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS操作フロー

血清・血漿・尿サンプルから精製した細胞外小胞の解析

ヒト血清から単離したエクソソームの収量比較

ヒト血清サンプル 1mL から本キット、超遠心分離法および表面抗原に対する抗体アフィニティー法によりエクソソームを回収し、ウェスタンブロット(抗CD9抗体、抗CD63抗体)により検出を行った。


レーン1:超遠心分離法
レーン2:MagCapture™
レーン3:A社 Exosome抽出キット(CD9)
レーン4:A社 Exosome抽出キット(CD63)
レーン5:A社 Exosome抽出キット(CD81)
レーン6:A社 Exosome抽出キット(CD9, CD63, CD81, EpCAM抗体ビーズ混合)
WBのデータについて
各サンプル結果は、150 μLの血清サンプルに相当します。
抽出物(100 μL)から15 μL抜き取り、4 x SDSサンプルバッファーを5 μL添加し、全量アプライしました。

MagCapture™ は、超遠心分離や抗体を用いたアフィニティー法よりもエクソソームの回収率が高い

ヒト EDTA 血漿サンプルからのエクソソームの単離

EDTA 血漿サンプル、EDTA 血漿(限界濾過でバッファー交換)、ヒト血清サンプル各 1 mL から本キットによりエクソソームを回収し、ウェスタンブロット(抗 Flotillin2 抗体)により検出を行った。


レーン1:EDTA 血漿
レーン2:EDTA 血漿(限外ろ過でバッファー交換)
レーン3:血清
検出抗体
抗 Flotillin-2 マウスモノクローナル抗体(29/Flotillin-2),BD Biosciences 社
使用サンプル量
各 1 mL
WBのデータについて
各サンプル結果は、150 μLの血清サンプルに相当します。
抽出物(100μL)から15 μL抜き取り、4 x SDSサンプルバッファーを5 μL添加し、全量アプライしました。

限外ろ過でバッファー交換をすることでより効率よくエクソソームを回収できる

ヒト尿サンプルから単離したエクソソームの収量比較

ヒト尿サンプル 1 mL から本キット、ポリマー沈殿法、超遠心分離法によりエクソソームを回収し、ウェスタンブロット(抗 CD9 抗体)により検出を行った。

マーカータンパク質回収量比較

レーン1:ポリマー沈殿法
レーン2:超遠心分離法
レーン3:PS アフィニティー法
検出抗体
抗 CD9 ウサギポリクローナル抗体(System Biosciences 社)
使用サンプル量
各 1 mL
WB のデータについて
各サンプル結果は、150 µL の尿サンプルに相当します。
抽出物(100 µL)から 15 µL 抜き取り、4 x SDS サンプルバッファーを5 µL 添加し、全量アプライしました。

粒子径比較
Size Distribution
Mean: 176 +/- 1.6 nm
Mode: 117 +/- 4.5 nm
SD: 96 +/- 5.8 nm
Size Distribution
Mean: 191 +/- 9.4 nm
Mode: 113 +/- 2.8 nm
SD: 88 +/- 7.4 nm
Size Distribution
Mean: 107 +/- 1.2 nm
Mode: 86 +/- 1.2 nm
SD: 42 +/- 1.0 nm

尿サンプルからもエクソソームを高純度に回収することができた

従来の沈殿法との性能比較実験

K562(ヒト慢性骨髄性白血病)細胞培養上清(無血清培地または10 %Exosome-depleted FBS添加培地)から本キット、超遠心分離法およびポリマー沈殿法を用いてエクソソームを回収し、回収量および純度を比較した。

MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS

遠心分離(10,000 x g, 30分間)前処理したK562細胞培養上清(無血清培地または10 %Exosome-depleted FBS添加培地) 1 mLからキットプロトコール(反応時間:3時間)に従ってエクソソームを回収した。

超遠心分離法

遠心分離(10,000 x g, 30分間)前処理したK562細胞培養上清サンプル(無血清培地または10 %Exosome-depleted FBS添加培地) 10 mLから超遠心分離(110,000 x g, 70分間)し、沈殿をTBSで懸濁後、再び超遠心分離(110,000 x g, 70分間)した沈殿画分を回収した。

ポリマー沈殿法

遠心分離(10,000 x g, 30分間)前処理したK562細胞培養上清(無血清培地または10 %Exosome-depleted FBS添加培地) 1 mLから市販のA社製品を用いて製品プロトコール(静置時間:終夜)に従いエクソソームを回収した。

取得エクソソームの電子顕微鏡解析およびNTA(ナノサイト)比較

K562細胞培養上清サンプル(無血清培地)から本キット、超遠心分離法、ポリマー沈殿法によって回収したエクソソーム画分の粒子径をナノサイトLM-10を用いて測定した。また、回収したエクソソーム画分(2~4 x 1010particles)を終濃度2 %パラホルムアルデヒドで固定化し、電子顕微鏡にて解析した。

電子顕微鏡画像 データ提供元:金沢大学 医学系 華山教授、大阪大学 iFReC 中井先生

MagCapture™ は 100 nm 前後の粒子が回収でき、電子顕微鏡でも多くの細胞外小胞が確認できた

K562細胞培養上清(無血清培地)からの回収量と純度の比較

K562細胞培養上清(無血清培地)から本キット、超遠心分離法、ポリマー沈殿法で回収したサンプルを電気泳動した後、銀染色およびウェスタンブロット(抗CD63抗体、抗Lamp-1抗体、抗Flotillin-2抗体)により検出を行った。

MagCapture™ は、エクソソーム回収率が高く夾雑タンパク質が最も少ないため純度と回収量のバランスが最も良い

K562細胞培養上清(10 %FBS添加培地)からの回収量と純度の比較

K562細胞培養上清(10 %Exosome-depleted FBS添加培地)から本キット、超遠心分離法、ポリマー沈殿法で回収したサンプルを電気泳動した後、銀染色およびウェスタンブロット(抗CD63抗体、抗Lamp-1抗体、抗Flotillin-2抗体)により検出を行った。また、各回収画分をMS解析し、同定した全ペプチドのうちK562細胞に由来するヒトペプチドの割合を比較した(培地に添加したFBSに由来するウシタンパク質凝集体が混入するほど、ヒト由来ペプチドの割合は低下する)。

MS解析 データ提供元:金沢大学 医学系 華山教授、大阪大学 iFReC 中井先生

MagCapture™ は、FBS 添加培地からも高純度なエクソソームが回収できるため低いバックグラウンドで MS 解析が可能

健常ヒト血清由来エクソソームからのmiRNAおよびmRNAの回収量比較

各手法で調製したエクソソームからのmicroRNAおよびmRNAの回収量比較

超遠心分離法とPSアフィニティー法で健常ヒト血清サンプルからエクソソームを単離した後、microRNA Extractor® SP Kit (製品コード:295-71701)を用いてRNAを回収し、定量PCR法によりmicroRNA量(let-7a, muR-16, miR-92a, miR-142-3p)およびmRNA量(GAPDH, PIK3CB)をCt値で比較した。

超遠心分離法よりPSアフィニティー法で回収したエクソソームの方が効率良くmicroRNAおよびmRNAを回収できた。

PSアフィニティー画分からのRNA抽出法の比較

PSアフィニティー法によって健常ヒト血清サンプルからエクソソームを単離した後、microRNA Extractor SP® Kit (製品コード:295-71701)、またはAGPC法によってRNAを回収し、定量PCR法によりmicroRNA量(let-7a, muR-16, miR-92a, miR-142-3p)とmRNA量(GAPDH, PIK3CB)をCt値で比較した。

AGPC法よりmicroRNA Extractor® SP Kitを用いることでエクソソームから効率良くmicroRNAおよびmRNAを回収できた。

エクソソームのプロテオミクス解析

実験内容および結果

PS アフィニティー法、超遠心分離法、ポリマー沈殿法を用いて、K562 細胞培養上清(10 % Exosome-depleted FBS 添加培地)からエクソソームを精製した。精製したサンプルを 10 % ポリアクリルアミド電気泳動で分離し、タンパク質バンド全体を切り出した。その後、ゲル内消化を行い、LC-MS でタンパク質を同定した。また、各手法で精製したエクソソーム (n=3) における同定タンパク質の pair-wise 相関の比較も行った。

同定したタンパク質の含有量トップ 10 比較

白カラム:エクソソーム由来ヒトタンパク質
灰色カラム:ウシ血清由来ウシタンパク質
赤字:エクソソームマーカータンパク質
サンプル:K562 細胞培養上清(エクソソーム除去済み 10% FBS 添加培地)

PS アフィニティー法 超遠心分離法 ポリマー沈殿法
1 Heat shock cognate 71 kDa Protein DNA-dependent protein kinase catalytic subunit Complement C3
2 Annexin A6 Transferrin receptor protein 1 Alpha-2-macroglobulin
3 Transferrin receptor protein 1 Serum albumin Fibronectin
4 V-type proton ATPase catalytic subunit A ATP-dependent RNA helicase A Serum albumin
5 Flotiillin-2 Tubulin beta-5 chain Thrombospondin-1
6 Programmed cell death 6-interacting protein Heat shock cognate 71 kDa protein Complement C4
7 4F2 cell-surface antigen heavy chain Fatty acid synthase Alpha-1-antiproteinase
8 Annexin A1 4F2 cell-surface antigen heavy chain Apolipoprotein B-100
9 Kinase D-interacting substrate of 220 kDa U5 small nuclear ribonucleoprotein helicase Hemoglobin fetal subunit beta
10 Annexin A2 Tubulin beta-4B chain Tubulin beta-5 chain

ポリマー沈殿法ではウシ血清由来タンパク質が多く混入しているのに対し、PS アフィニティー法ではエクソソームマーカータンパク質を多く同定できた

Pair-wise 相関を比較

サンプル:K562 細胞培養上清(10 % Exosome-depleted FBS 添加培地)

再現性
超遠心分離法
ポリマー沈殿法
PSアフィニティー法

参考文献:Sci Rep. 2016 Sep 23;6:33935. Nakai W et al.

同じ手法間の相関性を確認したところ、ポリマー沈殿法と PS アフィニティー法は相関性が高く超遠心分離法は少し相関性が低いことが分かった。
各手法間の相関性は低い結果となった。→各手法が精製してくるエクソソームの集団が異なる可能性が示唆された。

Protein Assay BCA Kit を用いたエクソソームのタンパク質濃度定量

Protein Assay BCA Kit は、溶液中のタンパク質濃度をビシンコニン酸(BCA)を用いて定量するキットで、タンパク質定量法の中でも最も汎用されています。原理は、塩基性条件下でタンパク質が Cu2+ を Cu+ に還元することに基づいています。Cu+ が BCA と錯体を形成すると紫色のキレートが生じ、タンパク質濃度に依存して紫色が濃くなるため、この紫色を 562 nm の吸光度で測定、標準曲線と比較することで溶液中のタンパク質濃度を定量します。

MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS を用いて細胞培養上清から精製したエクソソームのタンパク質濃度を、Protein Assay BCA Kit の高感度プロトコールにより測定しました。

実験内容および結果

96 ウェルプレート上に MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS から精製したエクソソーム溶液 25 μL を分注し、Protein Assay BCA Kit 付属の試薬 A と試薬 B の混合液を 200 µL 添加した。その後、60℃で 30 分間インキュベーションし、560 nm の吸光度を測定した(図 1)。この結果から、Protein Assay BCA Kit の高感度プロトコールで、精製エクソソームのタンパク質濃度を測定できることが示された。

BCA Assay プロトコール概要

エクソソームのタンパク質濃度はかなり薄いため、BCA 測定の場合はサンプルを希釈せず実施してください。

  1. スタンダード BSA 溶液 250、125、62.5、31.25、15.625 µg/mL およびスタンダード BLANK を 25 μL ずつ 96 ウェルプレートに添加する。
  2. エクソソーム精製品および Elution Buffer(BLANK) を 25 µL ずつ 96 ウェルプレートに添加する。
  3. Protein Assay BCA Kit(製品コード:297-73101)の試薬 A と試薬 B の混合液(A:B=50:1)を上記1. および2. に 200 µLずつ 添加する。
  4. 60 ℃で 30 分間インキュベートする。
  5. 室温でプレートを冷ます。
  6. 吸光度 560 nm を測定する。

エクソソームの標識と HeLa 細胞への取り込み実験

実験概要

MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS で精製したエクソソームを PKH67 (Sigma 社)で標識し、HeLa 細胞への取り込み能を確認した。

PKH67 を用いたエクソソーム標識

  1. MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS でエクソソームを精製する。(実験当日に COLO201 細胞培養上清からエクソソームを精製。)
    * 工程6-7 のゲル濾過処理時において、標識サンプルの吸着ロスを抑制したい場合は、キット添付の溶出液にEV-Save™ Extracellular Vesicle Blocking Reagent を添加してサンプル調製をしてください。
  2. BCA Assay および NanoSight を用いてサンプルのタンパク質濃度と粒子濃度を測定する。
  3. 1.5 mL チューブにエクソソームサンプル溶液を分注する。
    *今回は、タンパク質量で3 µg 相当のエクソソームを使用しましたが、標識に必要なエクソソーム量は、適宜調節してください。
  4. 2.0 µL の PKH67 linker を 0.25 mL の DiluentC(PKH67 キット添付)に溶解させる。…4 × Dye solution
    *標識に必要な量を適宜調製してください。
  5. サンプルに対して 1/3 量の 4 x Dye solution を添加し、混合後に室温で 5-10 分間インキュベーションする。
  6. Exosome Spin Columns (MW 3000)(Thermo 社 #4484449) を添付プロトコルに沿って PBS で平衡化する。
  7. 上記平衡化済みカラムに 100 µL ずつ各サンプルをアプライし、750 x g、2 分間遠心する。
    *カラム一本への最大添加量は100 µL のため、サンプル量が100 µL 以上の場合は必要本数用意してください。
  8. 前日ディッシュに播種しておいたHeLa細胞に溶液を全量添加し、24 時間後に顕微鏡観察およびフローサイトメーター解析を実施する。
    *添加するエクソソーム量を適宜調節してください。
  • 顕微鏡観察結果
  • フローサイトメーター解析結果
図1.PKH67 標識エクソソームの取り込み確認

MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS を用いて単離したCOLO201 由来エクソソームサンプル (総タンパク質量 3 µg、粒子数 1 x 1010個) について、PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit (Sigma 社) による標識を行った後、HeLa 細胞への取り込みを蛍光顕微鏡(左)とフローサイトメーター(右)で確認した。

PKH67標識されたエクソソームがエンドサイトーシスで取り込まれていることが、顕微鏡でもフローサイトメーターでも確認できた。また、EV-Save™ Extracellular Vesicle Blocking Reagent を添加したサンプルは、Dye を除去する時のゲル濾過カラムへの吸着ロ スを大きく抑制できている。

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