平成18年5月29日、残留基準が設定されていない農薬、動物用医薬品などを含む食品の流通を禁止する「ポジティブリスト制」が施行されてから１年あまりが過ぎました。約800種類の農薬類に基準値が設定され、GC/MS、LC/MS(LC/MS/MS)を用いた一斉試験法が厚生労働省より通知され、各施設で取り組み対応されています。当社では、これら一斉試験法に対応した混合液、標準品、溶媒類、及びGC用、HPLC用カラムなどを販売しています。今回、動物用医薬品の混合液をLC/MS/MS(MRM)法で分析した例をご紹介します。

厚生労働省より通知された一斉試験法には、"HPLC による動物用医薬品等の一斉試験法Ⅰ(畜水産物)"(89成分)、"HPLC による動物用医薬品等の一斉試験法Ⅱ(畜水産物)"(33成分)の分析条件が設定されています。動物用医薬品は確認試験としてLC/MS及びLC/MS/MS分析を採用している関係から、HPLC条件、MS検出イオン及び検出限界などの情報は公開されているものの、MS/MS検出条件などは各施設の装置で個別に設定する必要があります。

また、一斉試験法Ⅰでは、分析カラムに粒子径3 µmODS充てん剤を充てんした3.0mmφ x 150mmが採用され、分析時間は安定化も含めると約50分となっています。私達は分離を損なうことなくLC/MS/MS検出における分析時間の短縮を目的にカラム充てん剤、カラムサイズ及び検出感度について検討しました。検討の結果、本目的に使用するカラムは、Wakopak^® Wakosil-II 3C 18 HGが最適で、カラムサイズを3.0mmφ x 150mmから2.0mmφ x 100mmに変更することにより分析時間を約3分の1に短縮することができ、さらには、検出感度アップの効果も認められました。

その時の各カラムサイズに合わせたグラジエント条件とMRMで検出時のクロマトグラムを図１～４に、MS/MS検出イオンを表１、２に示しました。

表1．PL-1-2(22 sample)

Peak No.	Analyte Peak Name	Analyte Mass Ranges (amu)			Analyte Retention Time (min)
		Precursor	Product	Mode	3.0mmφ x 150mm	2.0mmφ x 100mm
1	Lincomycin	407.2	126.3	+	11.0	4.7
2	Sulfacetamide	215.1	92.1	+	11.5	4.7
3	Danofloxacin	358.2	82.2	+	12.9	5.2
4	Clenbuterol	278.2	204.2	+	13.7	5.5
5	Xylazine	221.1	90.1	+	13.6	5.5
6	Pyrimethamine	249.1	177.2	+	15.3	6.0
7	Trichlorfon(DEP)	258.9	109.1	+	15.6	6.1
8	Tilmicosin	869.6	174.2	+	15.5	6.2
9	Tiamulin	494.3	192.1	+	18.8	7.0
10	Prednisolone	361.2	147.0	+	19.4	7.3
11	Hydrocortisone	363.3	121.1	+	19.7	7.3
12	Dexamethasone	393.2	147.2	+	21.5	7.9
13	Emamectin B1a	887.5	158.3	+	25.2	8.9
14	Famphur	326.0	93.1	+	26.2	9.3
15	Fenobucarb(BPMC)	208.2	95.1	+	26.6	9.4
16	Temephos(Abate)	467.0	125.0	+	34.3	11.8
17	Allethrin	303.2	91.2	+	34.8	11.9
18	Eprinomectin B1a	914.5	186.3	+	35.8	12.2
19	Monensin	688.5	461.4	+	42.5	14.3
1	Florfenicol	357.8	184.8	-	17.6	6.8
2	2-Acetylamino-5-nitrothiazole	185.9	138.9	-	17.7	6.8
3	Clorsulon	379.7	343.9	-	18.9	7.1

表2．PL-2-1(24 sample)

Peak No.	Analyte Peak Name	Analyte Mass Ranges (amu)			Analyte Retention Time (min)
		Precursor	Product	Mode	3.0mmφ x 150mm	2.0mmφ x 100mm
1	5-Propylsulfonyl-1H- benzimidazole-2-amine	240.1	133.2	+	11.2	4.7
2	Levamisole	207.1	91.2	+	11.3	4.7
3	Thiabendazole	202.1	175.1	+	11.8	4.9
4	Trimethoprim	291.1	230.3	+	12.0	4.9
5	Sulfadiazine	251.1	92.2	+	12.3	5.0
6	Ormetoprim	275.2	123.1	+	12.5	5.1
7	Sulfathiazole	256.0	156.0	+	12.8	5.2
8	Sulfapyridine	250.0	156.2	+	13.2	5.3
9	Sulfamerazine	265.1	92.2	+	13.8	5.5
10	Thiamphenicol	355.9	308.0	+	14.4	5.7
11	Sulfadimidine	279.1	92.1	+	15.0	5.9
12	Sulfamethoxypyridiazine	281.1	156.1	+	15.0	5.9
13	Sulfamonomethoxine	281.1	156.1	+	16.1	6.2
14	Sulfachlorpyridazine	286.1	157.1	+	16.7	6.4
15	Sulfamethoxazole	254.0	156.0	+	17.5	6.6
16	Sulfadoxine	311.1	156.1	+	17.4	6.6
17	Ethopabate	238.2	136.0	+	19.3	7.2
18	Sulfaquinoxaline	301.0	156.2	+	19.4	7.2
19	Sulfadimethoxine	311.1	156.2	+	19.4	7.2
20	Sulfanitran	336.1	134.1	+	21.9	7.9
21	β-Trenbolone	271.2	165.3	+	23.2	8.3
22	α-Trenbolone	271.2	165.2	+	23.7	8.5
23	Melengestrol Acetate	397.2	279.4	+	31.3	10.7
1	Zeranol	321.1	277.2	-	24.2	8.7

• HPLC Conditions

  Column : Wakopak^® Wakosil-II 3C18 HG
  Eluent : A) 0.1% HCOOH in H₂O^＊
  B) 0.1% HCOOH in CH₃CN^＊＊
  Time program :

  Column size
  3.0mmφ x 150mm	2.0mmφ x 100mm	B conc.
  0-35 min.	0-10.5 min.	1-100 %
  35-40 min.	10.5-12 min.	100 %
  40-50 min.	12-22 min.	1 %

  Flow rate : 0.2 mL/min. at 40℃
  Injection vol. : 0.1 ppm、4 µL(3.0mmφ x 150mm)、
  3 µL(2.0mmφ x 100mm)

• MS/MS Conditions

  ESI, MRM

  IonSpray Voltage : 5,500V(pos), － 4,500V(neg)
  Temperature : 400℃ (pos)、500℃ (neg)
  Curtein gas : 20
  Collison gas : 6
  Ion Source Gas 1 : 50
  Ion Source Gas 2 : 80
  System : 3200Q TRAP(ABI)

HPLC分析においては、ピーク形状がシャープであればあるほど各成分の重なりが少なく、実試料分析におけるマトリクスの影響を抑える効果が期待できると考えます。また、HPLC分析条件とMS/MS検出条件の最適化は、定量精度や再現性に重要な要素です。当社では、Wakopak^®カラム及び混合液を使用して、ポジティブリスト制関連農薬及び動物用医薬品の一斉分析法の検討をお考えの方に、検出器3200Q TRAP(ABI社)で設定したメソッドの提供が可能ですので、ご一報いただければ幸いです。

参考文献

1. 「食品衛生法等の一部を改正する法律」(平成15年5月30日公布)．
2. 「食品中に残留する農薬、飼料添加物又は動物用医薬品の成分である物質の試験方法について(一部改正)」(平成17年11月29日公布)．