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【テクニカルレポート】ポジティブリスト関連品目のLC/MS/MS 分析

本記事は、和光純薬時報 Vol.74 No.4(2006年10月号)において、和光純薬工業 試薬研究所 吉田 貴三子が執筆したものです。

平成18年5月29日から「食品衛生法等の一部を改正する法律」(平成15年5月30日公布)、いわゆるポジティブリスト制がスタートしました。厚生労働省が通知した農薬や動物用医薬品の一斉分析法(通知法)において、HPLC法による農薬の一斉分析条件は、「LC/MSによる農薬等の一斉試験法Ⅰ」 (対象農薬42種類)、「LC/MSによる農薬等の一斉試験法Ⅱ」(対象農薬25種類)が定められています。通知法にはHPLC条件及びMS/MS検出イオン、検出限界などの情報は公開されていますが、MS/MS検出条件などは各施設の装置で個別に設定する必要があります。

また、HPLCカラムにおいてもピーク形状がシャープであるほど各成分の重なりが少なく実試料分析におけるマトリクスの影響を抑える効果が期待できます。このため、HPLCカラムの性能とMS/MS検出条件の最適化は、定量精度や再現性に重要な要素と考えられます。

そこで、私たちは、通知法Ⅰ対象農薬の中の30種類、通知法Ⅱ対象農薬の中の21種類をそれぞれ混合した農薬混合液PL- 7、PL- 8(ポジティブリスト制度 関連試薬参照:各単品農薬20ppm)を稀釈して試料とし、カラムの選定を目的に通知法通りのHPLC条件(UV検出)で分離状況を比較しました。その結果、ピーク形状と分離の状況からWakopak® Wakosil-II 3C18HG、2.0 x 150mmカラムが最適と判断しました。

次に、MS/MS検出器のメソッドについて、各農薬標準液の直接注入による各農薬のMS/MS検出条件の最適化と溶離液を使用したイオン化条件を検討しました。その検討結果に基づいて、農薬混合液PL- 7、PL- 8をメタノールで0.1 ppmに稀釈して分析しました。その時のクロマトグラムを図1~3に、検出イオンと各農薬の相対保持時間を表1、2にまとめて示しました。

  • Fig. 1. PL-7-1 pos(30 sample)
    Column size : 2.0 x 150mm
  • Fig. 2. PL-8-1 neg(13 sample)
  • Fig. 3. PL-8- 1 pos(8 sample)
  • HPLC Conditions

    Column : Wakopak® Wakosil-II 3C18 HG
    Eluent : A) 5mmol/L CH3COONH4 in H2O
    B) 5mmol/L CH3COONH4 in CH3OH
    Time program :

    Column size
    2.0 x 150 mm 2.0 x 100 mm B conc.
    0-1 min. 0-0.6 min. 15-40 %
    1-3.5 min. 0.6-2.1 min. 40 %
    3.5-6 min. 2.1-3.6 min. 40-50 %
    6-8 min. 3.6-4.2 min. 50-55 %
    8-17.5 min. 4.2-10.5 min. 55-95 %
    17.5-30 min. 10.5-18 min. 95 %
    30-40 min. 19-28 min. 15 %

    Flow rate : 0.2 mL/min. at 40℃
    Injection vol. : 0.1 ppm、3 µL

  • MS/MS Conditions

    ESI, MRM

    IonSpray Voltage : 5,500V(pos), - 4,500V(neg)
    Temperature : 400℃
    Curtein Gas : 20
    CollisonGas : 3
    Ion Source Gas 1 : 50
    Ion Source Gas 2 : 80
    System : 3200Q TRAP(ABI)

Table 1. PL-7-1(30 sample)
Ⅰ-30sample
(PL-7-1)
Peak No.
Analyte Peak Name Analyte Mass Ranges (amu) Analyte
Retention
Time (min)
Analyte
Retention
Time (min)
Parent Daughter Mode 2 x 150mm 2 x 100mm
1 Thiamethoxam 292.0 211.2 + 5.4 4.0
2 Clothianidin 250.0 132.1 + 6.4 4.7
3 Chloridazon (PAC) 222.1 77.2 + 7.4 5.3
4 Thiacloprid 253.0 126.0 + 8.3 5.9
5 Thiabendazole 202.1 175.1 + 10.3 7.0
6 Azamethiphos 325.0 183.1 + 11.0 7.4
7 Dimethirimol 210.2 71.1 + 13.7 8.8
8 Isoxaflutole 360.1 251.1 + 14.2 9.0
9 Azinphos-methyl 318.0 132.2 + 14.9 9.5
10 Pyriftalid 319.1 139.1 + 15.2 9.6
11 (E)-Ferimzone 255.2 91.2 + 16.0 10.1
12 (Z)-Ferimzone 255.2 91.2 + 16.0 10.1
13 Methoxyphenozide 369.2 149.2 + 16.3 10.2
14 Iprovalicarb 321.2 119.1 + 16.8 10.6
15 Chromafenozide 395.2 175.1 + 16.8 10.5
16 Butafenacil 475.1 331.1 + 16.8 10.5
17 Simeconazole 294.1 70.1 + 17.0 10.7
18 Oryzalin 347.1 288.2 + 17.1 10.7
19 Cyazofamid 325.1 108.0 + 17.2 10.8
20 Naproanilide 292.1 171.3 + 17.5 11.0
21 Fenoxycarb 302.2 88.1 + 17.6 11.0
22 Anilofos 368.1 199.1 + 18.0 11.3
23 Cyflufenamid 413.0 295.2 + 18.4 11.6
24 Pyrazolynate (Pyrazolate) 439.1 91.1 + 18.7 11.7
25 Indoxacarb (Indoxacarb-MP) 528.1 203.2 + 18.8 11.8
26 Benzofenap 431.0 105.2 + 19.4 12.2
27 Furathiocarb 383.2 195.3 + 19.6 12.4
28 Cloquintocet-mexyl 336.2 238.2 + 19.9 12.6
29 Milbemectin A 3 551.3 337.4 + 21.5 13.7
30 Abamectin B1a 890.6 305.3 + 21.5 13.7
Table 2. PL-8-1(21 sample)
Ⅱ-21sample
(PL-8-1)
Peak No.
Analyte Peak Name Analyte Mass Ranges (amu) Analyte
Retention
Time (min)
Analyte
Retention
Time (min)
Parent Daughter Mode 2 x 150mm 2 x 100mm
1 Flumetsulam 326.1 129.1 + 5.1 3.9
2 Thifensulfuron-methyl 388.0 167.2 + 5.8 4.4
3 Florasuram 360.0 129.3 + 6.5 4.9
4 Cloransulam-methyl 430.0 398.1 + 11.1 7.4
5 Diclosulam 406.0 161.1 + 11.6 7.7
6 Thidiazuron 221.0 102.1 + 11.6 7.7
7 Forchlorfenuron 248.1 129.2 + 14.4 9.1
8 Haloxyfop 362.1 316.2 + 15.6 9.8
1 Gibberellin (Gibberellin A3) 345.0 142.9 - 5.6 4.2
2 Fluroxypyr 252.9 194.7 - 5.8 4.3
3 4-Chlorophenoxyacetic Acid (4-CPA) 184.9 126.9 - 7.1 5.1
4 Bromoxynil 275.7 80.8 - 7.6 5.4
5 1 -Naphthaleneacetic Acid 184.9 141.0 - 8.5 6.0
6 Cloprop 198.9 126.7 - 8.7 6.1
7 Ioxynil 369.7 126.8 - 10.1 6.9
8 Triclopyr 255.8 197.9 - 11.5 7.6
9 Mecoprop (MCPP) 213.0 140.7 - 12.2 7.9
10 Dichlorprop 232.9 160.9 - 12.4 8.0
11 MCPB 227.0 140.9 - 14.4 9.1
12 Acifluorfen 359.9 316.1 - 15.0 9.4
13 Fomesafen 437.0 195.0 - 15.0 9.4

 

さらに、カラムサイズを2.0 x 100 mmまで短くした時のクロマトグラムを図4に示しましたが、分離を損なうことなく短時間分析が可能となり、スクリーニング分析として効果があるものと考えています。

Fig. 4. PL-7-1 pos (30 sample)
Column size : 2.0 x 100mm

 

参考文献

  1. 「食品衛生法等の一部を改正する法律」(平成15年5月30日公布).
  2. 「食品中に残留する農薬、飼料添加物又は動物用医薬品の成分である物質の試験方法について(一部改正)」(平成17年11月29日公布).

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