前回はスケールアップについて書いたので、今回は小スケールの反応での注意すべきことについてまとめてみました。

特に全合成をやっておられる方などには、以下の内容はほぼ常識的な内容かもしれません。研究室に配属された新人向けの内容としてご覧ください。

小スケールでの反応、(例えば1-10 mg) は通常のグラムスケールの反応と同じようにいきません。特に禁水反応や低温反応では、目的の反応が進行しないことがあります。既知物質の合成であれば、条件設定や手技に間違いがあったのかを考えればいいのですが、全合成研究のように新規物質を合成する場合はそういう訳にはいきません。考えうる失敗例を想像しながら、手技は少なくとも完璧にする。また、反応がうまく進行しなかったときも、その理由を考えて次の条件を試すという、PDCAサイクルを回す必要があります。失敗をしないためには、1）自分で失敗する、2）先輩や同期の失敗を見て勉強する、3）失敗例の引き出しを作っておく、の3つの方法が考えられますが、本記事はその3つ目に対応したものです。すべてを網羅していませんが、以下の点を注意するだけで失敗が減り、反応が進行しない原因が条件設定にある可能性を知る部分で役立つと思われます。

コンタミに気を付ける

• 小スケールに限りませんが、フラスコは毎回しっかりと洗います。反応によっては、アルカリバス (KOH) にフラスコやスターラーバーを漬けて洗浄し、コンタミを防ぎます。
• 固着物がある場合はアセトンを入れた状態にしてブラシでこすります。ハロゲン化物が固着物として考えられる場合はクロロ系の溶媒を用いてブラシで洗うなど、反応容器由来の残存物の対策をしっかりします。
• 机の上を整理しておきます。環境からのコンタミも可能性の一つです。
• サンプルの乾燥時に、きれいな三方コックを用いるようにします。

反応の仕込みに気を付ける

小スケールの場合、グラムスケールの反応と比べて厳密な無水条件、無酸素条件など厳しい条件が要求されます。例えば、1 g以上のスケールの反応では、低温の禁水反応でも塩カル菅の接続だけで充分な場合が多いですが、小スケールの場合はそうはいきません。

• 溶媒量が少なくなる場合は、ナシ型フラスコや、先の尖ったマイクロウエーブチューブなどを使います。
• 禁水反応の場合は特にですが、バーナーかヒートガンであぶっておきます。オーブンから容器を出したらすぐにアルゴンで置換します。
• 酸素のコンタミや水蒸気のコンタミが問題となる場合は、グローブボックス内で反応をセットアップします。
• 正確な秤量が求められる試薬や触媒を入れる必要がある場合、面倒臭くてもストック溶液を作成し、正確な量を用います。
• シリンジは使い捨ての1 mLのものではなく、容量に合わせたガスタイトシリンジ (10 µL, 25 µL, 50 µL, 100 µL, 250 µL, 500 µL) などの正確なシリンジを用いるべきです。(尚、何度も利用するシリンジでは強酸、強塩基の使用後はすぐに洗い乾燥します。塩基が固着すると、針がつまったり、錆の原因になります。)
• ある程度過剰量用いても差し支えない試薬の場合、小過剰の反応剤を用いるなど、試薬の失活も考慮に入れて反応条件を設定することが重要です (例えば、二級TBS化の場合は3 equiv.の2,6-ルチジンに2 equiv.のTBSOTfを用いたり、エステルの還元の場合は小過剰量の還元剤を用いるなど)。LDAなどの試薬はすこし大きめのスケールで調製して、濃度を計算してから一部を反応に利用する方法があります。
• ジクロロメタンなど揮発性の高い溶媒を少量用いる加熱反応では、しっかりとシーリングできるマイクロウェーブのバイアルを使ったり、可能ならば溶媒をDCE (1.2-ジクロロエタン) に置き換えて反応します。途中で溶媒を足すことも考慮に入れ、溶媒が完全に飛んでしまうことを防ぎます。
• 均一系触媒や溶媒に溶ける反応剤などの場合は、約10倍のストック溶液を作ったうえで、反応容器に添加します。不均一系触媒系での反応の場合、触媒の失活も考慮に入れて、通常よりも多めに触媒を入れるなどの工夫をします。

精製と計量に気を付ける

• 少量のコンタミでもNMRで見えるレベルになる場合があります。そのため精製には十分な注意が必要です。PTLCなどを使うと便利です。エバポのトラップもコンタミが無いように予め確認しておきます (アセトンなどで洗ってから濃縮するなど)。
• 必要に応じて、溶媒は蒸留したものを用います。THFやEt₂Oに含まれるBHT (重合禁止剤) などはNMRで見えてしまうことがよくあります。
• 少量の精製は、パスツールカラムやPTLCを用います。カラム精製を行っているうちに希釈されすぎて化合物を見失わないように、使用するシリカゲルの量についても注意します。特に、希釈されすぎたカラムのフラクションの場合、副生成物が見えずにきれいなフラクションと混ぜてしまうこともあるので注意が必要です。
• 精密天秤を用いて、化合物の重さを正確に秤量しましょう。計量の際はサンプルに埃やシリカゲルなどが残らないように注意します。もし、残っている可能性がある場合、パスツールに綿を詰めてろ過し、再濃縮して分析します。

分析する際に気を付ける

• MSは超微量分析もほぼ可能なので、問題になることはほぼないと思われます。
• NMRで分子量が大きく、微量の化合物を測定する場合、S/N比があまり良くない場合があります。解決策としては、シムが問題にならない程度の少なめの溶媒に溶かし、積算を重ねるというのが簡単な方法です。一方で、良いマシンに頼るという方法もあります。例えば、研究科にCryo-TCI probeのついたマシンなどがあるならば、1 mg未満でも1 scanでほぼ完璧な¹H-NMRスペクトルが得られます。例えば、分子量800ぐらいの化合物が0.5 mg程度用意でき、Cryo-TCI probeかCryo-BBO probeで4000回（3.5 h）ほど測定できれば¹³Cでもシグナルの検出が十分可能です。
• また、signalのbroadeningなどの影響で¹³Cが検出できなくても、同程度の時間HMBCかHSQCを用いれば、ほとんどのシグナルを拾えることが多いです。また、¹¹Bの付け根の¹³Cなど薄いNMR溶液ではかなり検出しにくいシグナルも二次元NMRで観測可能です。
• かなり希薄な溶液でNMRを取った場合、CDCl₃の両脇にsatellite peakが見える場合もありますが（CDCl₃に1%程度含まれる¹³Cによる¹J_C-H coupling (= 209 Hz) ）、こればかりはどうしようもありません。
• IRもFT-IRのATR (Attenuated Total Reflection (全反射測定法) ) マウントが開発されて以降、かなり少量で分析が可能となりました。NMRサンプルをパスツールピペットの先に少量取り、サンプルをロードした後乾かせば測定に十分な膜ができて測定できるはずです。

反応に失敗した場合

• その反応をどれくらいの濃度で実施したか確認します。濃度が著しく低い場合、反応速度が遅くなることがあります。
• 試薬の失活が起こっていないか確認します。プロトンを引き抜くという強塩基を用いた反応などでは、重水素化実験などがよいかと思われます。また、反応を進行させたいだけなら小スケールの反応の場合、触媒を多めに使ってみるというのも一案です。

関連リンク

• Siyakublog　スケールアップで失敗しないために　反応前の注意点