ScreenFect™A plus を用いた HeLa 細胞への plasmid DNA 導入実績及びリバーストランスフェクションプロトコールをご紹介します。

ScreenFect™A plus のクイックプロトコールは、当社データベースからダウンロードできます。

HeLa 細胞へのリバーストランスフェクションプロトコール例 （24ウェルプレート）

細胞の前培養

1. 適当な培養容器 （T-75 フラスコなど）を用いて、HeLa 細胞をセミコンフルエントになるまで培養する。

トランスフェクション試薬の調製

1. 滅菌処理した 1.5mL 容チューブを 2 本用意する。
2. 上記工程で用意した 1 本のチューブに ScreenFect™ Dilution buffer を 22 μL 添加する。
3. ２に 3 μL の ScreenFect™A plus Reagent を添加して全量で 25 μL にする。・・・溶液（A）
   （ScreenFect™A plus Reagent は使用前にボルテックスして下さい。）
4. １で用意したもう 1 本のチューブに ScreenFect™ Dilution buffer を 24 μL 添加する。
5. ４に 1 μL のプラスミド溶液を添加する。・・・溶液（B）
   （プラスミド溶液の濃度は 1 μg/μL とする。濃度が薄い場合、添加量が増えるので Dilution Buffer の量を調節して下さい。）
6. 溶液（A）のチューブに溶液（B）全量を添加する。
7. 混合したチューブをタッピングで良く混合し、卓上遠心機でスピンダウンする。
8. 室温で 5 〜 20 分間インキュベーションする。

細胞懸濁液の調製

1. 〈細胞の前培養〉で用意したフラスコをインキュベーターから取り出す。
2. 培地を捨て、PBS で１回洗浄する。
3. トリプシン溶液を 2 mL 添加し、室温または、37℃の CO₂ インキュベーターでインキュベーションし、細胞を培養容器から剥離させる。
4. FBS 添加培地を約 5 mL 添加し反応を止める。
5. ピペッティングでよく細胞を分散させ、遠沈管に全量移す。
6. 150 × g, 5 分間遠心する。
7. ペレットを捨てないよう上清を除く。
8. 新しい培地を 5 ～ 10 mL 添加し、ピペッティングで細胞を分散する。
9. 血球計算盤などの細胞カウンターを用いて細胞数を測定する。
10. 測定した結果から計算して、2.0 × 10⁵ cells/mL の細胞懸濁液を調製する（調製する細胞懸濁液量は実験スケールに応じて適宜調節する）。

トランスフェクション

1. 〈細胞懸濁液の調製〉で調液した細胞懸濁液 500 μL をウェルへ添加する。
2. 〈トランスフェクション試薬の調製〉の 8 でインキュベーションしておいた DNA-lipid complex 50 μL をウェルに添加し、プレートを軽く揺すって混合させる（ウェルに予め DNA-lipid complex 50 μL を添加しておき、そこに細胞懸濁液を 500 μL 添加しても構わない）。
3. CO₂ インキュベータで 24 ～ 48 時間培養し、実験に供する。

実験データ

HeLa 細胞へリバーストランスフェクション法で GFP 融合遺伝子の導入実験を行い、蛍光顕微鏡にて導入遺伝子の発現効率を比較しました。その結果、ScreenFect™A plus が最も高いGFP陽性細胞率を示しました。

〈HeLa細胞における性能比較〉（リバーストランスフェクション（1-STEP））

上記以外の ScreenFect™ シリーズの詳細情報は専用 HP をご覧ください。