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ボロン酸エステル/ヒドラゾンの協働が実現する強固な細胞Click反応

本記事はWEBに混在する化学情報をまとめ、それを整理、提供する化学ポータルサイト「Chem-Station」の協力のもと、ご提供しています。

細胞内クリック反応のモデル図

概要

2017年、アルバータ大学・Dennis G. Hallらは、細胞毒性の低いボロン酸とジオール間でのボロン酸エステル形成に注目し、これをヒドラゾン形成と組み合わせることで不可逆的に複合体を形成し、生細胞コンジュゲーションに応用することに成功しました。

課題設定とその解決

"Synergic "Click" Boronate/Thiosemicarbazone System for Fast and Irreversible Bioorthogonal Conjugation in Live Cells"
Akgun, B., Li, C., Hao, Y., Lambkin, G., Derda, E., Hall, D. G.: J. Am. Chem. Soc., 139, 14285 (2017). DOI: 10.1021/jacs.7b08693

毒性の低い試薬で細胞内でも進行する生体直交反応は、生体分子の細胞内機能を理解するのに役立つツールです。特に低濃度・水系溶媒中で高い反応性・選択性を示し、副生成物がなく高収率で進行する"クリック"ケミストリーは、開発の中心となっています。

このような反応開発を目指し、Hallらはボロン酸エステル形成に基づく新規な生体直交反応を報告しました1)。nopoldiol誘導体および2-メチル-5-カルボキシメチルフェニルボロン酸によって得られるボロン酸エステルの安定性は高いが、水中で逆反応がわずかに進行してしまうことが問題でした。

そこで、生体直交反応の文脈で用いられるイミン・ヒドラゾン・オキシム形成に注目し、それを第2の相乗的相互作用とすることでより安定な複合体を合成できると考え、試薬骨格の最適化を行っています。

ジオール構造をnopodiolに固定し、様々なC=X結合を意図した相互作用部位構造の組み合わせ検討を行なったところ、オルト位にメチルケトンをもつボロン酸、フェニルヒドラジンよりも安定・安全だとする報告2)があるチオセミカルバジドをnopodiolに2炭素リンカーで連結させた冒頭図のような組み合わせが最適構造として得られました。反応を行ったところ、50 μMで3.5時間以内に定量的な複合体形成が達成されました。

クリック反応における逆反応がない複合体の形成

有効性の検証

①生体条件下における複合体の安定性確認

ボロン酸+ジオールチオセミカルバジド試薬で複合体を組ませた後、別のボロン酸を過剰量加えて数日放置してもボロン酸の交換は観測されませんでした。希釈条件、pH =3及び9のバッファーに対しても安定であり、複合体の開裂は観測されませんでした。

②反応の生体直行性の実証

ポリオール構造は糖をはじめとする様々な生体分子に存在します。そこでグルコース (8 mmol/L)、フルクトース (300 µmol/L)、またはカテコール (0.1 µmol/L) 存在下にボロン酸+ジオールチオセミカルバジド試薬の複合体形成を行なったところ、夾雑物のある/なしで反応の結果が変わりませんでした。このことから、生体ポリオールは反応に影響しないことが示されました。また、タンパク質の翻訳後修飾によってケトンおよびアルデヒド構造が導入されうることが報告されています3, 4)。それを模したグリオキシルアルデヒドに対しジオールチオセミカルバジド試薬を作用させましたが、チオセミカルバゾンの形成は確認されませんでした。

③生細胞への応用可能性

それぞれの試薬に対して細胞毒性試験を行ったところ、反応時間相当 (18 h) の試験時間では目立った毒性は見られませんでした。

その後、HEK293T細胞表面にSNAPタグ法を用いてボロン酸を固定したものを用意し、フルオレセイン結合型ジオールチオセミカルバジド試薬を反応させ、蛍光顕微鏡で観察したところ、細胞表面が蛍光標識されていることが分かりました。ジオールを欠いたチオセミカルバジド試薬を代わりに用いたところ、表面蛍光が観測されなかったことから、両方の協働作用が標識に必須であることがわかります。

細胞を用いた検証実験の手順と結果

参考文献

  1. Akgun, B., Hall, D. G.: Angew. Chem., Int. Ed., 55, 3909 (2016). DOI:10.1002/anie.201510321
  2. Bandyopadhyay, A., Cambray, S., Gao, J.: J. Am. Chem. Soc., 139, 871 (2017). DOI: 10.1021/jacs.6b11115
  3. Matthews, M. L., He, L., Horning, B. D., Olson, E. J., Correia, B. E., Yates, J. R., Dawson, P. E., Cravatt, B. F.: Nat. Chem., 9, 234 (2017). DOI: 10.1038/nchem.2645
  4. Prescher, J. A., Bertozzi, C. R.: Nat. Chem. Biol., 1, 13 (2005). DOI: 10.1038/nchembio0605-13

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