本記事は、富士フイルム和光純薬 試薬開発マーケティング本部 バイオ技術センター 山口 真由、町田 佑樹が執筆したものです。

はじめに

抗体は、特定の分子を高い特異性で認識して結合する性質を持つタンパク質である。この性質を利用して、生命科学研究における研究用試薬をはじめ、疾患の診断に用いられる体外診断薬、さらには抗体医薬品など、幅広い分野で活用されている。中でもモノクローナル抗体は、単一のＢ細胞クローンに由来し、特定のエピトープを認識する均一な抗体であることから、高い特異性と再現性を示す。また、継続的に同一の抗体クローンを産生できることから、安定した品質で供給できる点も大きな特長である。近年、抗体の用途や標的分子はますます多様化し、抗体に求められる特性も広がっている。より高い親和性や特異性に加え、生体内に近い立体構造を保持した抗原を認識する抗体の取得も重要となっている。特に膜タンパク質は複雑な立体構造を持つことから、その構造を保持した状態で免疫・スクリーニングを行うことが抗体取得における重要な課題となる¹⁾。目的の抗体を効率よく取得するためには、免疫法だけでなく、目的の抗体を産生するB細胞を選抜し、モノクローナル抗体として取得するまでの一連の技術が必要となる。

本記事では、当社が構築してきたDNA免疫法と独自のB-cell Cloning技術を組み合わせたウサギモノクローナル抗体作製技術について、その基礎技術を概説するとともに、次回記事では膜タンパク質に対する抗体取得への応用事例やサービス展開を紹介する。

ウサギ抗体の特徴

抗体作製にはマウスやラット、ウサギなどさまざまな動物が利用されている。ウサギは、特徴的な抗体多様化機構を持ち、これによって多様な抗体レパートリーが形成される。さらに、抗原刺激後の親和性成熟により、抗原に対してより高い親和性を持つB細胞が選択され、高親和性抗体の産生につながる。これらの免疫学的特徴を背景に、ウサギ由来抗体では、高い親和性・特異性を示す抗体や、多様なエピトープを認識する抗体が得られることが報告されており ^{2, 3)}、研究・診断分野で幅広く使用されている。また、こうした特長から、ウサギではげっ歯類で十分な免疫応答が得られにくい抗原に対しても抗体取得が期待でき、構造が複雑な膜タンパク質だけでなく、ホルモンなどの低分子抗原や、リン酸化修飾などのわずかな構造変化を識別する抗体の取得にも有用とされている³⁾。

高性能なウサギ抗体の取得を目指したDNA免疫法の活用

当社はこれまで、マウスおよびラットを用いたDNA免疫法により、複数回膜貫通タンパク質を含むさまざまな標的分子に対する抗体を作製してきた (表1)。DNA免疫では、標的分子のcDNAを組み込んだ発現ベクターを免疫動物に投与し、生体内で抗原タンパク質を発現させることで免疫応答を誘導する。本手法は、動物自身の細胞で抗原を発現させるため、天然に近い立体構造を保持した状態 (native form) の抗原を認識する抗体を取得しやすいという利点がある。複雑な立体構造を持つ膜タンパク質では、合成ペプチドや組換えタンパク質を用いて抗原本来の立体構造を再現することが難しい場合があり、DNA免疫はこのような抗原に対して特に有用な免疫法である^{4, 5)}。さらに、抗原のnative formを認識する抗体は、標的分子の機能を調節する活性を示す可能性もある⁵⁾。当社では、Claudin-5 ⁶⁾やCTGF ^7-10)に対する中和活性を有する抗体を取得した実績もある。そこで当社は、これまで培ってきたDNA免疫法をウサギへ展開し、高性能なウサギモノクローナル抗体の開発を目指した。

※2024年3月末時点
※成功率は抗体取得成功件数／実施件数を示す。

抗原のnative formを維持した抗体スクリーニング法: EV-Screening法

Native formの抗原を認識する抗体を取得するには、抗体スクリーニング過程においてもnative formを保持した抗原が必要である。そこで当社では、細胞膜上に発現する膜タンパク質が細胞外小胞 (Extracellular vesicles、以下EV) 表面にもその構造を保持したまま提示される性質に着目し、標的膜タンパク質を哺乳類細胞に発現させ、その分子を表面に提示したEVを作製して抗体スクリーニングに活用した。具体的には、EVの表面に存在するphosphatidylserine (PS) に特異的に結合するTim4タンパク質を活用した当社独自の「PSアフィニティー法」により、標的膜タンパク質を提示したEVを精製・濃縮した¹¹⁾。さらに、Tim4を介して取得したEVをスクリーニングウェル内に固相化し、十分量の抗原を提示することで抗原抗体反応の検出感度を向上させた (図1)。

B-cell Cloning技術では、多数のB細胞の中から目的の抗体を産生するB細胞を1細胞レベルで選抜し、その細胞から抗体遺伝子を取得して組換え抗体を作製することで、単一B細胞に由来するモノクローナル抗体を取得する (図2)。当社では、1細胞が入る程度の微小ウェルに標的膜タンパク質を提示したEVを固相化してB細胞を播種し、各B細胞から分泌された抗体とEV上の標的膜タンパク質との反応を検出することで、native formの膜タンパク質を認識する抗体を産生するB細胞を効率的に単離する技術を開発した (図2 ②)。
このように、標的膜タンパク質を提示したEVの作製技術、PSアフィニティー法を活用したEVの精製・固相化技術、シングルセル解析技術を組み合わせることで、新たな抗体スクリーニング系「EV-Screening法」を構築した (特許公開番号：WO2024071374)。

1細胞からの抗体遺伝子取得

目的の抗体を産生するB細胞を単離した後、次に重要となるのが、そのB細胞がもつH鎖とL鎖の抗体遺伝子をペアで取得する工程である (図2 ③)。当社では、単離した1個のＢ細胞から、RT-PCRにより生体内で形成されたH鎖とL鎖の組み合せを保持したまま、両鎖の抗体遺伝子を単離・増幅する技術を構築した。1細胞から得られるmRNA量はごくわずかであり、さらにB細胞ごとに抗体遺伝子の配列が異なる。そのため、多様な抗体遺伝子を共通のプライマーで効率よく増幅するためには、プライマー設計が非常に重要となる。当社では、ウサギ抗体配列解析に基づいて独自のプライマーを設計することで、高確率でH鎖とL鎖の抗体遺伝子をペアで増幅することを可能にした。さらに増幅した抗体遺伝子に哺乳細胞での発現に必要な配列をPCRにより付加することで、発現ベクター構築を介さずに多数の候補抗体を一過性発現させ、迅速に性能を評価できる系を構築した。これにより、多数の候補から抗体性能をもとにクローンを絞り込み、選択した抗体クローンのみを発現ベクター化する効率的な抗体スクリーニングが可能となった。

本稿では、ウサギDNA免疫、EV-Screening法、B-cell Cloning法を組み合わせた抗体作製技術について紹介した。これらの技術により、native formの抗原を認識するB細胞の選抜から、抗体遺伝子の取得、組換え抗体としての評価までを一連のフローとして実施できる。

次回は、本技術を実際の抗体作製に適用した具体的な事例を通して、得られた抗体の特性やサービスへの展開について紹介する。

［参考文献］

1. Dreyer, A. M., et al.: BMC Biotechnol., 10, 87 (2010).
2. Rossi, S., et al.: Am. J. Clin. Pathol., 124, 295-302 (2005).
3. Weber, J., Peng, H. and Rader, C.: Exp. Mol. Med., 49, e305 (2017).
4. Attanasio, R., Pehler, K. and Scinicariello, F.: FEMS Immunol. Med. Microbiol., 17, 207-215 (1997).
5. Liu, S., Wang, S. and Lu, S.: Emerg. Microbes Infect., 5, 1-12 (2016).
6. Hashimoto, Y., et al.: J. Pharmacol. Exp. Ther., 363(2), 275 (2017).
7. Ikawa, Y., et al.: J. Cell. Physiol., 216(3), 680 (2008).
8. Nozawa, K., et al.: Arthritis Rheum., 65(6), 1477 (2013).
9. Miyashita, T., et al.: Autoimmunity, 49(2), 109 (2016).
10. Miyazaki, O., et al.: Ann. Clin. Biochem., 47, 205 (2010).
11. 富士フイルム和光純薬株式会社：「エクソソーム単離/精製キット」

※掲載しているイラストは「BioRender.com」を使用して作成しています。