アミノ酸分析専用カラム

Wakopak^® Wakosil^®-PTC

PITCラベル化法により得られる定量性の良いPTC誘導体化アミノ酸を定量することによって、アミノ酸組成を分析するカラムです。専用溶離液A, Bの2種類でグラジエント分析を行います。従来の様に複雑なグラジエント溶離法ではなく直線グラジエントのため専用装置が不要で、ほとんどのグラジエントHPLC装置で分析できます。

特長

• 専用溶離液による直線グラジエント溶出
• 汎用HPLC装置で分析可能
• 高感度：1 pmolまでの分析が可能
• 小さいロット間差、高い再現性

PTC誘導体化アミノ酸　17種の一斉分析例

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• Column	：Wakopak®Wakosil-PTC(4.0 mm x 200 mm)
  Eluent	：A) PTC-Amino Acids Mobile Phase A ：B) PTC-Amino Acids Mobile Phase B 　linear gradient 　0 → 15 min. B 0 → 70%
  Flow Rate	：1.0 mL/min. at 40℃
  Detection	：UV 254 nm 0.32 AUS
  Sample	：PTC-Amino Acids soln. (250 pmol)

Wakosil-PTC文献：井上逸男, 福本昌巳, 上森仁志, 佐方由嗣, 庄司省三, 久保田幸穂：生化学, 61, 1012 (1989)

PTC-アミノ酸　誘導体化方法(当社推奨法)

誘導体化手順

1. 試料(10 pmol - 500 nmol程度)およびアミノ酸混合標準液H型 10 μL(25 nmol)を各々エッペンドルフチューブにとる。
2. 減圧下に乾燥する。
3. エタノール／精製水／トリエチルアミン(TEA)混合液(2/2/1) 20 μLを加え攪拌する。
4. 減圧下に乾燥する。
5. エタノール／精製水／TEA／PITC混合液(7/1/1/1) 20 μLを加え攪拌する。
6. 室温にて20分間反応させる。
7. 減圧下に乾燥する。
8. 分析まで冷凍保存する。
9. 分析時に溶離液Aに溶解して分析する。
   (標準アミノ酸の場合1 mLに溶解し、10 μLインジェクションすると250 pmolに相当する。試料は適当量の溶離液Aに溶解して分析する。)

• 誘導体化反応

  

• • 試料を標識する際には必ず標準液も同時に標識し、その標準液の分析結果を用いて試料中のアミノ酸の定量計算を行います。
  • 標識した試料は乾燥状態では冷凍保存(-20℃)により3ヶ月程度は使用できます。溶離液Aに溶解したものは、冷凍保存により数日間は使用できます。

Wakopak^® Wakosil PTH-II φ4.6 mm x 250 mm (S-PSQ)

タンパク質やペプチドの一次構造分析用カラムです。エドマン分解によって生じたPTHアミノ酸をWakosil^®-PTHカラムとPTHアミノ酸専用溶離液を用い、イソクラティック条件で短時間に再現性よく高感度に分析が可能です。また、試料に適した前処理を行うことにより、食品・医薬品・培地および液体などのアミノ酸にも応用できます。

特長

• 20種類の(PTH誘導体化)アミノ酸を迅速(25分以内)に分析が可能
• 操作が簡単なイソクラティック溶離法
• 高感度で再現性の高い分析が可能

PTH誘導体化アミノ酸20種の一斉分析例

Column	：Wakopak®Wakosil-PTH-II(4.6 mm x 250 mm)
Eluent	：PTH-Amino Acids Mobile Phase
Flow Rate	：1.0 mL/min. at 40℃
Detection	：UV 269 nm
Sample	：1) Asp　2) Glu　3) Asn　4) Gln　5) Ser 　6) Thr　7) His　8) Gly　9) Ala　10) Tyr　11) Arg　12) Δ Thr　13) Met　14) Val　15) Pro　16) Trp　17) Phe　18) Lys　19) Ile　20) Leu

Wakosil-PTH文献：井上逸男, 福本昌巳, 上森仁志, 佐方由嗣, 森田直樹, 奥村毅：生化学, 60, 876 (1988)

Wakopak^® Wakosil PTH-GR (S-PSQ)(for Gradient Elution)

島津製作所製全自動タンパク質一次構造分析装置PPSQシリーズ(グラジエントシステム)で使用する専用カラムです。

島津製作所製全自動タンパク質一次構造分析装置PPSQ-50では、エドマン分解終了後にHPLCカラムで分析を行いますが、分析カラムに注入するサンプル容量は50 μLです。セミミクロカラムを用いたグラジエント溶離を行うことで従来のイソクラティック溶離に比較してPTH-アミノ酸のピークの高さは、イソクラティック溶離よりも、全体的に3 〜5 倍程度高く検出が可能です。

PTH-アミノ酸標準混合品2 pmol のグラジエント溶離によるクロマトグラムを図(a)に、イソクラティック溶離によるクロマトグラムを図(b)に示ます。

プロテインシーケンサは、当該サイクルとその前サイクルとのPTH-アミノ酸ピークの増減を比較し、特異的に検出されているPTH-アミノ酸の同定を行います。イソクラティック溶離は、移動相の組成が一定のため、遅い溶出時間の疎水性アミノ酸はピークの高さが低くなりますが、一方、グラジエント溶離では、分析時間が経つにつれ、溶出力の高い移動相B の濃度が高くなるため、疎水性の高いPTH- アミノ酸の分離が改善されます(図 a)。

グラジエント溶離では、500 fmolのPTH-アミノ酸の分離および検出も可能となりました。

Wakopak^® Ultra APDS TAG^®

本製品は、アミノ酸分析試薬(LC/MS用)(APDSタグ^®)を用いて誘導体化されたアミノ酸類を分析するのに最適なUHPLC用カラムです。
APDSタグ^®を用いたLC/MS試験において、ロイシンとイソロイシン等、同一のm/zを持つアミノ酸も分離検出することが出来ます。

分析例①(36種アミノ酸のLC/MS分析)

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  分析条件

  カラム	Wakopak® Ultra APDS TAG®
  流速	0.3 mL/min. at 40℃
  検出	質量分析計、トリプル四重極、ESI positive、MRMモード
  溶離液A	APDSタグ®ワコー用 溶離液
  溶離液B	60%アセトニトリル溶液

  
  

  グラジエント条件

  時間(分)	0	0.05	1.7	1.71	4.95	5.95	5.96	6.7	6.71	12
  B(%)	6	8	8	12	30	60	95	95	6	6

• No.	対象アミノ酸類	略称	Q1	Q3
  1	2-アミノエタノール	EtOHNH2	182.1	121.0
  2	グリシン	Gly	196.1	121.0
  3	サルコシン	Sar	210.0	121.0
  4	アラニン	Ala	210.1	121.0
  5	4-アミノ酪酸	GABA	224.1	121.0
  6	3-アミノイソ酪酸	β-AiBA	224.0	121.0
  7	2-アミノ酪酸	α-ABA	224.0	121.0
  8	セリン	Ser	226.1	121.0
  9	プロリン	Pro	236.1	121.0
  10	バリン	Val	238.1	121.0
  11	トレオニン	Thr	240.1	121.0
  12	タウリン	Tau	246.1	121.0
  13	ヒドロキシプロリン	Hypro	252.1	121.0
  14	イソロイシン	Ile	252.1	121.0
  15	ロイシン	Leu	252.1	121.0
  16	アスパラギン	Asn	253.1	121.0
  17	アスパラギン酸	Asp	254.1	121.0
  18	グルタミン	Gln	267.1	121.0
  19	グルタミン酸	Glu	268.1	121.0
  20	メチオニン	Met	270.1	121.0
  21	ヒスチジン	His	276.2	156.0
  22	α-アミノアジピン酸	α-AAA	282.1	121.0
  23	フェニルアラニン	Phe	286.2	121.0
  24	1-メチル-L-ヒスチジン	1MeHis	290.2	170.0
  25	3-メチル-L-ヒスチジン	3MeHis	290.2	170.0
  26	アルギニン	Arg	295.2	175.1
  27	シトルリン	Cit	296.3	121.0
  28	チロシン	Tyr	302.2	121.0
  29	トリプトファン	Trp	325.2	121.0
  30	カルノシン	Car	347.2	227.1
  31	アンセリン	Ans	361.3	241.1
  32	オルニチン	Orn	373.5	121.0
  33	リシン	Lys	387.5	147.0
  34	5-ヒドロキシリシン	HyLys	403.5	163.0
  35	シスタチオニン	Cysthi	463.2	223.1
  36	シスチン	Cys2	481.2	121.0

分析例②(アミノ酸含有飲料中のアミノ酸類の定量)

試料前処理および誘導体化条件

サンプル

サンプル　：市販のアミノ酸含有飲料
内部標準液：APDSタグ^®ワコー用アミノ酸内部標準混合液

LC/MS/MS条件

測定結果

クロマトグラム

市販飲料中アミノ酸6成分のMRMクロマトグラム

市販飲料に標準を添加した試料のMRMクロマトグラム

成分名	検出イオン (m/z)		Mode	成分名	検出イオン (m/z)		Mode	成分名	検出イオン (m/z)		Mode
	Precursor	Product			Precursor	Product			Precursor	Product
Gly	196.1	121.0	+	Ile	252.1	121.0	+	Asn	253.1	121.0	+
Gly-IS	199.1	121.1	+	Leu-IS	255.1	121.1	+	Asp	254.1	121.0	+
Ala	210.1	121.0	+	Ile-IS	259.1	121.1	+	Gln	267.1	121.0	+
Ala-IS	213.1	121.1	+	Arg	295.1	175.1	+	Glu	268.1	121.0	+
Val	238.1	121.0	+	Arg-IS	299.1	179.1	+	α-AAA	282.1	121.0	+
Val-IS	244.1	121.1	+	Sar	210.0	121.0	+	Cit	296.3	121.0	+
Leu	252.1	121.0	+	Hypro	252.1	121.0	+				+

回収結果