BDNF ELISAキット

BDNFはNGF(神経成長因子)ファミリーに属しており、神経発生・神経保護作用・シナプス形成などに関与し、うつ病をはじめとした精神疾患マーカー候補と考えられています。また神経分野以外にも心疾患、糖尿病、痛風、歯周病、ストレス、運動などにも関連することが報告されており、幅広い分野で研究のターゲットとなっています。
BDNFには前駆体であるproBDNFが存在し、proBDNFの一部が切断されることでmBDNF (mature BDNF)となります。proBDNFは生体内でp75 NTR受容体に結合し、mBDNFとは異なる作用を有することが報告されております。
本品はmBDNFを特異的に検出するELISAキットです。

総説: BDNFと精神疾患 -Mature BDNF定量解析が拓く新たな研究戦略-

脳由来神経栄養因子 (Brain-Derived Neurotrophic Factor / BDNF) は神経機能の発達、維持に重要な役割を果たす分子である。近年では種々の疾患への関与が報告され、バイオマーカーへの利用にも期待が高まっている。BDNFは前駆体 (ProBDNF) がプロセシングを受けて成熟体 (MatureBDNF / mBDNF) になるが、ProBDNFとmBDNFが全く異なる効果を有するため、mBDNFを正確に解析する手法が求められている。

脳由来神経栄養因子 (Brain-Derived Neurotrophic Factor / BDNF)

BDNFは、1982年にBardeらが脳に高頻度で発現する神経栄養因子の1つとしてブタの脳から単離した分泌型タンパク質である。BDNFはニューロトロフィンファミリーにおいて2番目に同定された神経栄養因子であり、神経系の発生期から成熟期にかけて脳内において広く分布している。その代表的な作用としては、高親和性受容体であるTropomyosin related kinase B (TrkB) を介した神経細胞生存促進、シナプス形成促進が知られている (1 , 2)。このように神経機能の形成や維持に寄与する重要な因子であることから、BDNFは神経科学分野において非常に注目されている。

バイオマーカーへの期待

BDNFは精神疾患のような脳に起因する疾患に深く関わることが指摘されている (3)。特にうつ病においてはKaregeらがうつ病患者の血清中におけるBDNFが健常者に比べて低値であることを初めて報告して以降 (4)、バイオマーカーとしての利用が期待されている。抗うつ剤を使用していないうつ病患者においては特にその減少が認められる点からも、BDNFの定量解析がうつ病治療の指標に利用できる可能性がある。また、近年ではいくつかのメタ解析からうつ病のみならず双極性障害や統合失調症においても血清中のBDNFの低下が示唆されている (5)。これらを総合的に勘案すると、現時点では特定の精神疾患におけるBDNFの特徴的な変化は不明であるが、種々の精神疾患の鍵因子である可能性が高い。

成熟体BDNF、前駆体BDNF

BDNFは前駆体BDNF (ProBDNF) として発現して分泌部位に輸送され、プロセシングを受けて成熟体BDNF (Mature BDNF / mBDNF) になる (6)(図1)。前駆体であるProBDNFは生理的役割を担っていないと考えられていたが、近年mBDNFとは全く異なる生理的役割を有することが明らかになってきた。 mBDNFはTrkBを介して長期増強 (Long-term potentiation / LTP) を誘導し、神経新生や発達を促進する。一方ProBDNFは低親和性受容体であるp75NTRを介して長期抑制 (Long-term depression / LTD) を誘導することで、神経のアポトーシスを促進する (7) (図2)。このようなプロセシングの違いで効果が変化する点は、BDNFに極めて複雑な神経系の制御機構が存在することを示唆する。以上より、種々の精神疾患のメカ二ズムを明らかにするうえで、mBDNFを正確に解析する手法が求められる。

図1. ProBDNF、およびMature BDNFの構造。
ProBDNFのN末端側が切断を受けMature BDNFとなる。

 

 

図2. ProBDNFおよびmBDNFの効果。
ProBDNFは、p75NTRを介してアポトーシスや神経突起成長抑制を誘導するのに対し、
mBDNFはTrkBを介してシナプスや神経突起成長を誘導する。

Mature BDNF検出技術の開発

mBDNFにはProBDNFに対する特異的配列が存在しないため (図1)、mBDNF特異的な検出の難易度は非常に高い。これに対して当社は、mBDNFのN末端側をエピトープとする特異性、検出感度に優れた抗体を用いたELISAキット、Mature BDNF ELISAキットワコーを開発した (図3, 4)。本製品で使用している抗体はProBDNFへの交差性が約10%と非常に低いことから、mBDNAを特異的かつ高感度で検出することが可能である (表1)。ヒト由来血清、血漿を用いた添加回収試験においてはいずれも90%以上の回収率であることが確認された (表2)。本製品は、希釈直線性試験においても極めて優れた定量性が確認されており (図5)、女性の大うつ病、躁うつ病、および統合失調症患者に由来する血清検体に含まれるmBDNFが健常者に比べて低値である傾向を示した(表3)。以上の結果から、今回当社が開発したMature BDNF ELISAキットワコーは精神疾患分野において強力な技術ツールになることが期待される。

 

図3. Mature BDNF ELISAキットワコーの原理
Mature BDNFのN末端側を認識する抗体を使用することでMature BDNF特異的に検出できるELISAキットの開発に成功した。

 

  • 検量線範囲 4.1~1,000 pg/mL
    測定対象 mBDNF※1
    測定対象検体 ヒト血清、ヒト血漿※2
    必要検体量 ヒト血清:10 μL(10倍希釈時)
    ヒト血漿:5 μL(20倍希釈時)
    測定時間 4時間
    検出法 発色系

    ※1 proBDNFとの交差反応性は約10%です。
    ※2 ヒト、マウス、ラットBDNFを認識する抗体を用いています。

     

    図4. Mature BDNF ELISA キットワコーの性能

 

表1. ProBDNF交差率とMature BDNF検出感度比較

本品 A社同等品 B社同等品 C社同等品
ProBDNF交差率 約10% 約10% 約15% 約50%
感度
(検量線下限値)
4.1 pg/mL 62.5 pg/mL 15.6 pg/mL 15.0 pg/mL

 

図5. 希釈直線性試験
mBDNFの希釈直線性を検討したところ、優れた直線性が確認された。

 

 

表2. ヒト血清、および血漿を用いた添加回収試験の結果

検体 添加量
(pg/mL)
測定値
(pg/mL)
回収量
(pg/mL)
回収率
(%)
検体 添加量
(pg/mL)
測定値
(pg/mL)
回収量
(pg/mL)
回収率
(%)
ヒト
血清①
0 330 ヒト
血漿①
0 156
100 423 93.0 93.0 100 252 96.0 96.0
250 581 251 100 250 407 251 100
500 817 487 97.4 500 661 505 101
ヒト
血清②
0 56.6 ヒト
血漿②
0 66.0
50 106 49.4 98.8 50 115 49.0 98.0
100 154 97.4 97.4 100 164 98.0 98.0
200 257 200 100 200 276 210 105
300 363 306 102 300 369 303 101

 

 

表3. 大うつ病、躁うつ病、統合失調症、および健常者由来血清のMature BDNF測定値

  • 健常者(n=6)
    No. 性別 年齢 測定値
    (ng/mL)
    1 F 48 14.5
    2 F 50 22.8
    3 F 54 20
    4 F 47 18.5
    5 F 42 13.8
    6 F 60 19.1
  • 大うつ病(n=6)
    No. 性別 年齢 測定値
    (ng/mL)
    1 F 66 15.7
    2 F 38 18.1
    3 F 43 10
    4 F 52 16.6
    5 F 41 22.3
    6 F 58 15.1
  • 躁うつ病(n=4)
    No. 性別 年齢 測定値
    (ng/mL)
    1 F 46 16.5
    2 F 52 20.9
    3 F 52 11.5
    4 F 52 11.5
  • 統合失調症(n=4)
    No. 性別 年齢 測定値
    (ng/mL)
    1 F 36 17.9
    2 F 53 23.0
    3 F 55 14.6
    4 F 51 10.8
健常者 大うつ病 躁うつ病 統合失調症
18.1±3.41 16.3±4.02 15.1±4.53 16.6±5.17

(ng/mL)

最後に

精神疾患患者は世界的に増加の一途をたどっており、精神疾患に関する研究は現在も盛んに取り組まれている。その中でも今回紹介したBDNFは、種々の疾患に関わっていることが示唆されており、その注目度は非常に高まっている。当社が新たに開発した「Mature BDNF ELISAキットワコー」は、極めて高い特異性と検出感度の両立を実現させた全く新たなmBDNF検出技術であり、今後さらに活発化するであろう精神疾患分野において、mBDNFの有用な検出技術として貢献できると考えている。

参考文献

    1. Schinder and Poo, The neurotrophin hypothesis for synaptic plasticity. Trends Neurosci 23 (12) : 639-645 (2000)
    2. Huang and Reichardt, Neurotrophins: Roles in neuronal development and function. Annu. Annu Rev Neurosci 24 : 677-736 (2001).
    3. Hempstead, Brain-derived neurotrophic factor: three ligands, many actions.Trans Am Clin Clim Assoc 126 : 9-19 (2015).
    4. Karege et al., Decreased Serum Brain-Derived Neurotrophic Factor Levels in Major Depressed Patients. Psychiatry Res 109 (2) : 143-148 (2002).
    5. Cattaneo et al., The human BDNF gene: peripheral gene expression and protein levels as biomarkers for psychiatric disorders. Transl Psychiatry 6 (11) : e958 (2016).
    6. Lessmann and Brigadski, Mechanisms, Locations, and Kinetics of Synaptic BDNF Secretion : An Update. Neurosci Res 65 (1) : 11-22 (2009).
    7. Barker, Whither proBDNF Nat Neurosci 12 (2) : 105-106 (2009).

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