アイソイル ラージ, ビーズ破砕用 バージョン2 ISOIL Large for Beads ver.2

ISOIL Large for Beads ver.2 は、5 g の土壌サンプルからDNA を抽出するキットです。界面活性剤による化学的な溶菌と、ビーズによる物理的な菌体破砕（ボルテックス）を併用することによって、効率よく土壌DNA を抽出することができます。
抽出の基本プロトコールに加え、再精製やスケールアップのための2 つのオプションプロトコールも設定されており、充実した内容になっています。
オプションプロトコールによって試薬が不足する場合は 単品でご購入ください。

特長

• 5 g の土壌サンプルからDNA が抽出可能（基本プロトコール）
• 黒ボク土などの火山灰土壌からも効率よく土壌DNA が抽出可能
• 土壌中の腐植物質を効率よく除去でき、高純度な土壌DNA の抽出が可能
• オプションプロトコールに対応できる十分な試薬量を確保
• より高純度な土壌DNA を得るための再精製が可能（オプション①）
• 20 g までのスケールアップが可能（オプション②）

使用回数

基本プロトコールでDNA 抽出を8回行うことができます。
オプションプロトコールによって試薬が不足する場合は単品でご購入ください。

保存方法

ISOIL Large for Beads ver.2 に含まれる試薬はすべて室温保存が可能です。
ただし、Precipitation Solution、Wash Solution、Ethachinmate については、使用時のコンタミネーション（カビや雑菌等の混入）に十分注意し、開封後は低温（2～10°C）で保存することをお奨めします。

基本プロトコール

オプションプロトコール① 土壌DNAの再精製

1. 得られた土壌DNA 300 µlを新しい1.5 mlチューブに移し、200 µlのPurification Solutionを添加し、十分に混合する。
2. 300 µlのクロロホルムを添加し、15秒間ボルテックスした後、遠心（12,000 x g, 15分間, 室温）する。
3. 中間層を入れないように注意しながら水層（上層）400 µlを新しい1.5 mlチューブに移し、400 µlのPrecipitation Solutionを添加して十分に混合し、遠心（20,000 x g, 10分間, 4°C）する。
4. 上清を捨て、500 µlのWash Solutionを加えて沈殿およびチューブ壁をリンスし、遠心（20,000 x g, 10分間, 4°C）する。
5. 上清を捨て、500 µlの70%エタノールと1 µlのEthachinmateを加えてボルテックスした後、遠心（20,000 x g, 5分間, 4°C）する。
6. 上清を捨て、風乾した後、沈殿を適量（100～300 µl程度）のTE（pH8.0）に溶解する。

オプションプロトコール② 微量なDNAを回収するためのスケールアップ

1. 土壌サンプルを5 gずつ、4本のBeads Tube L に入れる。（計20 g）
2. 各チューブに、9.5 mlのLysis Solution BBと0.5 mlのLysis Solution 20Sを添加する。
3. 最高速度で10 分間ボルテックスした後、65°Cで60分間インキュベートする。
4. 遠心（4,000 x g, 5分間, 室温）する。
5. 沈殿を入れないように注意しながら、上清を6 mlずつ新しい50 ml チューブ 4本に移し、各チューブに4 mlのPurification Solutionを添加し十分に混合する。
6. 各チューブに6 mlのクロロホルムを添加し、1 分間ボルテックスした後、遠心（4,000 x g, 15分間, 室温）する。
7. 中間層を入れないように注意しながら、水層（上層）を2本分ずつ新しい50 mlチューブに移し、各チューブに等量のPrecipitation Solutionを添加して十分に混合し、遠心（8,000 x g, 60分間, 4°C）する。（4本のチューブを2本にまとめる）。
8. 上清を捨て、各チューブに5 mlのWash Solutionを加えて沈殿および遠沈管の壁をリンスし、遠心（8,000 x g, 10分間, 4°C）する。
9. 上清を捨て、各チューブに5 mlの70%エタノールと10 µlのEthachinmateを加えてボルテックスした後、遠心（8,000 x g, 10分間, 4°C）する。
10. 上清を捨て、風乾した後、沈殿を適量（0.3～1 ml程度）のTE（pH8.0）に溶解する。

抽出した土壌DNA の電気泳動

2種類の土壌サンプル5gからDNA抽出を行った。得られたDNAの1 / 200量を電気泳動した結果、土壌DNAを確認することができた。

Lane 1　OneSTEP Marker 1（λ/Hind III digest）
Lane 2　東京大学 弥生圃場 対照区土壌（黒ボク土 / 火山灰土壌）
Lane 3　秋田県立大学 実験圃場 水田土壌（灰色低地土 / 非火山灰土壌）
1% Agarose S

オプションプロトコール①＜土壌DNAの再精製＞の効果

腐植物質を多く含む黒ボク土から標準プロトールで抽出精製した土壌DNAを、オプションプロトコール①で再精製した。

東京大学　弥生圃場　対照区　（黒ボク土）	東北農業研究センター内圃場　畑　（黒ボク土）

結果
標準プロトコールで精製した土壌DNAにはやや着色が見られたが、オプションプロトコール①で再精製することで、無色透明な溶液になった。また、吸光スペクトルの結果より、いずれの土壌DNAも再精製を行うことでより高純度に精製することができた。この再精製におけるDNAの回収率は70%前後であった。