脳オルガノイド・神経オルガノイド

大脳は、脳の半分以上の体積を占め、知覚、思考、言語、注意、エピソード記憶、随意運動などの複雑な現象の根底にある司令塔としての役割を担っていると考えられています。大脳オルガノイドは、ヒトの脳発達の十分に理解されていないプロセス、特にヒトの進化の過程で顕著な種特異的拡大と多様化を遂げた集団、例えば上皮質層の外側放射状グリア (outer Radial Glia：oRG) や脳梁投射ニューロン (Callosal Projection Neurons：CPN) などのヒト皮質細胞の多様化の事象を研究するための有望なモデルとして活用されています。

in vivoにおける大脳皮質の発生と構造

大脳皮質は、以下のような発生過程を経て形成されます。

• 初期増殖期 (神経上皮の増殖)
  神経管閉鎖後、神経上皮細胞 (Neural Epithelium Cell：NEC) が対称分裂による自己複製を繰り返し、神経上皮プールを増殖させます。
• 神経新生 (ニューロンの供給)
  神経新生の開始に伴い、NECは放射状グリア細胞 (Radial Glial Cell：RGC) へと変化します。脳室側に位置する細胞体を持ち、脳表面の基底膜側 (basal側) に突起を伸ばすRGCは特にaRGC (apical Radial Glia Cell) と呼ばれます。aRGCは非対称分裂を行い、1つのaRGCと、中間前駆細胞 (Intermediate Progenitor Cell：IPC) もしくはニューロンを産生します。
• 6層構造形成
  aRGCが生成したニューロンが深層 (V/VI層) から上層 (II/III/IV層) へと配置され、異なる6層構造を形成します。
• 辺縁帯 (MZ) による制御
  大脳皮質原基以外の場所から発生したCajal-retzius細胞が、接線方向に移動して辺縁帯 (Marginal Zone：MZ) を構成し、ニューロンの適切な層配置を制御します。

①Pre-patterning (指向性誘導法)

外部から外因性シグナル (低分子化合物や増殖因子) を添加し、目的の脳領域へと指向性を持たせて誘導する手法です。

従来のマウスES細胞からの神経分化誘導は、血清添加下での胚様体 (Embryoid Body：EB) 形成が主流でしたが、神経分化効率の低さがネックとなっていました。これに対し、笹井・渡辺らは無血清培地を用いた浮遊培養法「SFEB法」を開発しました。終脳、脳室帯、脳室下帯、中間層に特異的に発現する転写因子『Foxg1』の誘導に成功し、終脳前駆細胞の誘導が確認されました。またROCK阻害剤を培養系に導入することで細胞生存率が大幅に改善し、ヒト細胞での再現が可能となりました。

しかし、SFEB法は、形成される細胞塊のサイズにばらつきがあり、Foxg1陽性細胞の誘導効率は50%を下回るなど再現性に課題を残していました。この問題を解決したのが永樂らの「SFEBq法」です。低接着性96wellプレートを用いて細胞を迅速に強制凝集させることで、均一な細胞塊の作製に成功しました。これにより、Foxg1発現効率は最大75%に達しました。

②Self-patterning (自発的・非指向性誘導法)

外因的なパターニング因子に頼らず、幹細胞が本来持つ内在的な自己組織化 (Self-organization) 能力を最大限に利用する手法です。

Lancasterらによるプロトコールは、外因性のシグナル因子を使用せず、幹細胞の内在的な分化能 (Self-patterning) を促進する方法です。化合物での制御を行わない代わりに、EBをマトリゲル液滴に包埋し、回転式バイオリアクターを用いた旋回培養を行うことで、栄養の吸収と3次元的な細胞の成長を促進させます。
この培養系により、脳室様の空洞を囲む形でN-cadherinの先端極性を示す神経上皮シートが形成されます。10ヶ月以上の長期培養が可能であり、大脳皮質組織のほか、脈絡層や網膜を思わせる構造も同時形成されます。初期は前脳・中脳・後脳のマーカーの発現が確認されたが、培養が進むにつれて前脳の発現が高く維持されます。
外因性因子によるパターニングを行わないにもかかわらず、最終的には前脳マーカーFoxg1や皮質マーカーEmx1の発現が確認されます。さらに、組織内には脳室帯、脳室下帯、皮質板に類似した層構造や、霊長類特異的な神経幹細胞であるbRGC様の構造とマーカーの発現が確認されています。

ヒト幹細胞由来ニューロンは、創薬や重篤な神経疾患の治療法の開発において重要な基盤となるほか、神経発達、機能、疾患の解明に向け広く研究されています。近年、その生理学的モデリングにおいて、適切な多細胞組織と微小環境の重要性が明らかになり、多細胞構造をより正確に再現するシステムとして、in vitro3次元「オルガノイド」培養システムの活用が進んでいます。

領域化オルガノイド

領域化オルガノイドとは、多能性幹細胞 (iPS細胞など) から立体的に臓器や組織を作成する際、生体内の発生プロセスを再現し、単一のオルガノイド内部に特定の機能的・構造的な領域 (パターニング) を作り出す技術やその組織です。

領域化オルガノイドの例

上記で紹介したオルガノイドの他にも、以下に記載するような多くのオルガノイドの作製方法が報告されています。

① 脈絡叢 (Choroid Plexus) オルガノイド

背内側終脳領域の最背側に位置する蓋板 (Roof plate) に由来し、発生期において高濃度のBMPおよびWntシグナルが発現する領域で形成されます。大脳皮質への誘導条件をベースとし、神経領域化が完了する培養18日目以降に、Canonical Wntシグナル活性化剤 (CHIR99021) およびBMP4タンパク質を継続的に添加します。これにより、LMX1A/OTX2/トランスサイレチン陽性の脈絡叢上皮組織が3次元で効率良く誘導されます。

②海馬 (Hippocampus) オルガノイド

内側終脳の内側外套に由来し、大脳皮質と脈絡叢の中間に位置します。
脈絡叢誘導と同様にCHIR99021とBMP4を使用しますが、添加期間を培養18〜21日目の3日間に限定します。これにより背内側終脳が誘導されます。長期培養 (60日以上) により海馬マーカー (ZBTB20) や歯状回ニューロンマーカー (PROX1) が発現します。

③脊髄 (Spinal Cord) オルガノイド

脊髄の発生期において、オーガナイザーから分泌される因子の濃度勾配 (背側のBMP/Wnt、腹側のShhシグナルなど) により、背側は6つの前駆細胞ドメイン、腹側は5つの前駆細胞ドメインへと分割されます。
従来の運動ニューロン誘導プロトコルから、あえてBMP阻害剤 (LDN-193189) とShhアゴニスト (SAG) を除去することで、より広範な背側〜中間領域の連結神経上皮を誘導します。ここに、外因性SAGを濃度依存的に添加することで、脊髄の中間領域あるいは腹側領域へとパターニングを自在に制御することが可能です。

④腹側終脳 (Ventral Telencephalon) オルガノイド

主に抑制性介在ニューロンを産生する領域であり、外側基底核原基 (lateral ganglionic eminence:LGE)、内側基底核原基 (medial ganglionic eminence：MGE)、尾側基底核原基 (caudal ganglionic eminence:CGE) などの領域から成ります。
ShhシグナルによってLGE (GSH2陽性)、MGE (NKX2.1陽性)、CGE (CoupTFII陽性) へとパターニングされます。大脳皮質分化条件の培養15〜21日目において、低濃度 (30nM) のSAG添加では、PAX6 (大脳皮質) とGSH2 (LGE) が連続上皮の中で形成されます。一方、高濃度 (500nM) のSAG添加を行うと、PAX6やGSH2の発現は抑制され、NKX2.1陽性の神経上皮が効率良く誘導され、完全な腹側化が達成されます。