MagCapture (TM) Exosome Isolation Kit PS Ver.2 MagCapture (TM) Exosome Isolation Kit PS Ver.2

PSアフィニティー法について

本製品の原理はどのようなものですか。

エクソソームをはじめとする細胞外小胞 (EV: Extracellular Vesicle) の膜表面に存在するホスファチジルセリン (PS) と 金属イオン依存的にPSに結合する Tim4というタンパク質を利用してエクソソームなどの細胞外小胞を単離する手法です。

どのような細胞外小胞が精製できますか。

ホスファチジルセリンを脂質膜表面に露出しているエクソソームやマイクロベジクルを精製することができます。

エクソソームとマイクロベジクルを別々に精製できますか。

エクソソームとマイクロベシクルは大きさで明確に区別できないため完全に分けることはできませんが、 本製品では各々の主要な画分を得るために以下の簡便な分離方法を推奨しています。

エクソソームを始めとする粒子径が小さい細胞外小胞 (small EVs) を単離・精製する場合は、 10,000 x gで遠心分離した上清をサンプルとして使用してください。

マイクロベシクルを含む粒子径が大きい細胞外小胞 （large EVs） を精製する場合は、 まず 1,200 x gで遠心分離した上清を回収し、それを 10,000 x g で遠心分離して得られる沈殿をTBSに懸濁してサンプルとしてご使用ください。

また、両方を一緒に精製する場合は、1,200 x gで遠心分離した上清をサンプルとしてご使用ください。

PSアフィニティー法ではEV以外も単離されるのでしょうか。

エンベロープを持つウイルスを回収してくることがわかっています。エンベロープ型のウイルスの膜表面にもホスファチジルセリンが露出しているため、エンベロープ型ウイルスが混入しているサンプルでは、両方回収されます。そのためPSアフィニティー法はエンベロープ型ウイルスの回収に応用できる可能性があり、実際に PSアフィニティー法を用いたウイルス精製の報告がございます²⁾。
なおウイルスを分離したい場合は、PSアフィニティー法で回収後、ウイルスに特異的な抗体を用いたアフィニティー精製を行う必要があります。これはPSアフィニティー法に限らず、エンベロープ上に存在するCD63などのEVマーカータンパク質に対する抗体を使った精製法でも同様のことが言えます。

<参考文献>
2) M. Santiana, et al.: Cell Host Microbe, 24, 208(2018).

全てのEVがPSを露出していますか。

全てのEVがPSを露出していることを示す知見は得られていませんが、下記論文において、クライオ電子顕微鏡解析および免疫金コロイド粒子を用いた活性化血小板由来EVの表現型解析が報告されています³⁾。本論文では、活性化血小板由来のEVの約75%がPSを表面に露出していることが報告されています。
3) Brisson, A. R., et al.: Platelets, 28(3), 263(2017).

当社の検討ではPSアフィニティー法による精製の前後で、試料に含まれるEV数をNTA法やELISA法を用いて比較すると、ほとんどの細胞や体液サンプルで、ほぼ90%以上のEVが回収されていることが確認されています。特にPSアフィニティー法で精製したEVでは、超遠心分離法やサイズ排除クロマトグラフィー法に比べて、低アニオン性EVの割合が高く、高アニオン性EVの割合が低いことが判明しました。

他のEV単離手法と比較した場合のPSアフィニティー法のメリットは何ですか。

超遠心分離法
高純度なEVを簡便に再現性良く高効率で回収することができます。また、超遠心分離法では沈殿しにくいようなサンプルからもEVを回収できることを確認しています。回収されるEVの純度も高く、超遠心分離法と密度勾配遠心法を組み合わせた場合と同等レベルの高純度なEVを回収することができます。さらにPSアフィニティー法では、同一原理でリッタースケールの細胞培養上清やサンプルを96検体同時処理が可能です。

ポリマー沈殿法
ポリマー沈殿法より回収効率が高く、高純度のEVが取得できます。

抗体アフィニティー法
抗体アフィニティー法は、EV表面抗原に対する抗体を用いているため変性剤による溶出や酸性条件下でEVを解離させて回収する必要があります。PSアフィニティー法は、中性条件下でキレート剤を用いて溶出するため、インタクトなEVを回収することができます。またビーズに非特異吸着したタンパク質の混入が少なく、より高純度なEVを回収でき、回収効率が高いことも確認しています。さらにPSアフィニティー法は膜脂質成分をターゲットとしているため、1種類のEV表面マーカータンパク質をターゲットとした抗体アフィニティー法より、広い範囲のEVを回収できると考えられます。

サンプルについて

どのようなサンプルから精製できますか。

細胞培養上清、血清、血漿 (ヘパリン、EDTA、くえん酸)、尿、糞便から回収した実績があります。またユーザーより、脳脊髄液や唾液からのEV精製実績が報告されています。乳由来のEVは、乳中に含まれるアネキシンⅤがEV表面のPSに結合し、Tim4との結合を阻害する可能性があります。

どのような動物種から単離できますか。

ヒト、マウス、ラット、イヌ、サルなどから単離した実績があります。

精製に用いるサンプルの最低量はどのくらいですか。

安定的にビーズとサンプルを混合するために、ローテーターを用いて反応を行う場合は 500 μL 以上、チューブミキサーを用いて反応を行う場合は 100 μL 以上のサンプルを用いてください。 これより少ない量のサンプルを用いる場合は TBS を加えて最低量以上としてから Exosome Capture 固定化ビーズと反応させてください。また、フィルアップに用いるTBS には、EV-Save™ 細胞外小胞ブロッキング試薬 (コードNo. 058-09261) の添加を推奨します。

多量のサンプルから回収できますか。

本製品を使用する場合、細胞培養上清15 mL程度であれば濃縮せずに単離・精製が可能です。また濃縮などを行うことで50 mLまでのサンプルに対応できます。その場合、遠心分離前処理済みの細胞培養上清50 mLを1 mLまで限外ろ過濃縮してください (推奨フィルター: ザルトリウス社Vivaspin20、分画分子量100 K、メーカーコード: VS2041)。無血清培地だけではなく10%FBS添加培地にも対応できます。血清サンプルは濃縮できないため、使用できるのは1 mLまでです。 なお当社ではPSアフィニティー法を用いた細胞培養上清からのEV大量精製カラムとしてMassivEV™ EV Purification Column PSも販売しております。

限外濾過濃縮で分画分子量100K が推奨されていますが、10K は使用できませんか。

当社にて100 K、300 K、1,000 Kの限外濾過フィルターを比較し、濃縮時間および濃縮できたEV量の結果から100 Kを推奨しています。より小さな10 Kや30 Kも使用可能だと思われますが、濃縮時間が長くなる可能性があります。また、アルブミンを含む培地の場合、アルブミンが濃縮されるため、回収効率が低下する可能性があります。

血漿 (EDTA、くえん酸) サンプルにおけるヘパリン濃度の推奨はありますか。

当社では終濃度5 mUとなるようにヘパリンを添加しています。未添加でも5倍以上希釈すれば測定可能ですが、希釈時に凝集が見られることがあるので、ヘパリン添加を推奨します。

収量について

1回あたりのEVの取得量はどれくらいですか。

サンプルの種類や量により大きく異なりますが、モネンシンナトリウムでEV分泌を亢進させた K562細胞培養上清 5 mLを 1 mLに濃縮してから精製操作を行った場合に、1回の精製操作でタンパク質量にして約30 μg/mL程度 (BCA 法で測定)、粒子数にして 1-2 x 10¹⁰ particles/mLの粒子が取得できています。また正常ヒトプール血清1 mLから1回の精製操作でタンパク質量にして約34 μg/mL程度、粒子数にして5 x 10⁹ particles/mL程度の粒子が回収できています。

EVの最大収量はどれくらいですか。

1アッセイの最大収量は約1-5×10¹⁰ particlesです。

1個のBiotin Capture Magnetic Beadsに結合するBiotin-labeled Exosome Captureも1個でしょうか。また、一つのExosome Capture固定化ビーズに捕捉されるEV数はいくつでしょうか。

1個のBiotin Capture Magnetic Beadsに対して複数のBiotin-labeled Exosome Captureが結合します。したがって1つのExosome Capture固定化ビーズに対して複数のEVが捕捉されます。

キット構成・操作について

溶出液の組成は何ですか。

1 mmol/Lのキレート剤、塩を含むPBSベースの溶液です。溶出液が以降の解析を阻害する場合は、限外ろ過 (ザルトリウス社 VivaSpin500、分画分子量100 K、メーカーコード： VS0141) もしくはゲルろ過により、適切なバッファーに置換してください。

本製品の操作で、特に慎重に行った方が良い操作は何ですか。

Exosome Capture固定化ビーズとサンプルを反応させた後の洗浄ステップ最終段階で、洗浄液をしっかりと除去することです。完全に除去したことを確認後、溶出操作に入ってください。また溶出ステップでビーズに溶出液を加えた後、ビーズが凝集していないか確認しながらしっかりと懸濁してください。

実験操作を翌日まで持ち越せるステップはありますか。

Exosome Capture固定化ビーズとサンプルを反応させるステップは終夜で反応させても問題ありません。反応時は冷蔵を推奨します。

Exosome Capture を固定化した使用後の磁気ビーズのリサイクルは可能ですか。

可能です。サンプル中に残存するEVを再回収するため、使用した磁気ビーズを4回まで再生利用可能です。バッファー類も十分量同梱されていますので、同一サンプルからの繰り返し抽出やコンタミネーションしないケースであれば、最大50回 (10回用キットの場合) 使用可能な仕様となっています。またReaction Tubeもキット添付のWashing Bufferなどで洗浄すれば再利用可能です。 容量が1 mL 以上のサンプルから回収を行う場合や濃縮サンプルから回収する場合におすすめいたします。

Exosome Capture 固定化磁気ビーズの保存は可能ですか。

可能です。EVを溶出した後のExosome Capture固定化ビーズを再利用する場合は、別途調製したTBSを用いて冷蔵保存し、できるだけ早くご使用ください。

アプリケーションについて

精製した細胞外小胞は、どういった解析に使用できますか。

インタクトな細胞外小胞が得られますので、あらゆる解析に利用できます。

<解析例>
・タンパク質解析：タンパク質電気泳動、ウエスタンブロッティング、プロテオミクス解析、フローサイトメトリー、ELISA など
・核酸解析：qPCR、マイクロアレイ、次世代シークエンスなど
　粒子解析：電子顕微鏡解析、Nanoparticle Tracking ・Analysis (NTA)など
・機能解析：in vitro、in vivo での投与実験など

各アプリケーションに必要なEVの量はどれくらいですか。

当社での実績を以下に記載します。

実験	サンプル量 (例)
電子顕微鏡解析	2-4 x 1010 particles/mL
マイクロアレイ解析	COLO201: 4.6 x 1010 particles TIG3: 1.7 x 1010 particles iPSC: 1.9 x 109 particles
プロテオミクス解析	精製EV 約1 μg (Nakai, W. et al.: Sci. Rep., 6(1), 1(2016))
ウエスタンブロッティング	溶出液100 μL の内、15 μLを使用

精製したEVの保存はどうすれば良いですか。

EV-Save™ 細胞外小胞ブロッキング試薬を添加し、冷蔵または冷凍での保存を推奨しています。また、長期間保存する場合は-80℃で保管してください。EV-Save™細胞外小胞ブロッキング試薬を添加した状態で12ヶ月保管可能であることを確認しています。ただし、本製品はポリマーを含むため、プロテオミクス解析に使用する場合には、EV-Save™を除去する工程が必要です。

単離したEVはそのまま細胞への添加実験に使用できますか。

本製品の溶出バッファーは細胞毒性が低く、in vitro やin vivo の投与実験が可能です。ただし、溶出バッファー中のEDTAが問題となる場合はバッファー交換が必要となります。

トラブルシューティング

細胞培養上清から上手く精製できません。どのようにすれば良いですか。

ポジティブコントロールをご用意ください。ポジティブコントロールは、HEK293など任意の細胞を培養していただき、細胞培養上清を必要量調製し、本製品を用いてEVを単離することで得られます。また培地中のEV量が少ない可能性があります。培養スケールを大きくしたり、培養条件を見直したりすることをご検討ください。

回収効率を向上させる方法はありますか。

サンプルによっては通常プロトコルより Biotin-labeled Exosome Capture の固定化量を減少させることで回収効率が向上する場合があります。 通常プロトコルで回収効率が低いサンプルについては、Biotin-labeled Exosome Captureの添加量を減らして下さい (例 : 10 μL → 2-5 μL)。

本製品で精製したEVサンプルの総タンパク質量が他の単離手法と比較して少ないのは何が原因ですか。

他の手法で回収したEVサンプル中には、多くの不純物が混入しているため、総タンパク質量が多くなります。一方、本製品で精製したEVサンプルの総タンパク質量は少ないですが、サンプルの純度が高いため、実際に得られるEV量は他の単離手法と比較して同等以上と考えています。

磁気ビーズがマグネットスタンドに集まりません。原因として考えられることはありますか。

サンプル中のキレート剤として働く成分 (くえん酸など) によって磁気ビーズの構成成分である鉄が酸化してしまい、吸着能が低下している可能性があります。