LysoPure™ Protein Extraction-PTS Solution

プロテオミクス (Proteomics) は、サンプル中に存在するタンパク質を網羅的に解析する手法です。サンプルからタンパク質を抽出後、消化酵素で断片化し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析計 (LC-MS/MS) でペプチドの構造情報を取得することで分析をおこないます。これまでLC-MS/MSではカラムや充填剤の改良、MSの高感度化・高速化など多くの改良が重ねられ、現在では複数サンプルの同時分析や低発現タンパク質の定性・定量分析が可能になっています。
LC-MS/MSの前工程であるタンパク質抽出や断片化もプロテオミクスの結果を大きく左右します。これらの工程ではいかにロスなく、多くのタンパク質を抽出し、断片化できるかが肝心です。特に膜タンパク質は疎水性が高いため、抽出が難しいことが知られています。プロテオミクスで膜タンパク質まで抽出しようとすると強力な可溶化剤を使用する必要があります。しかしながら、強力な可溶化剤はその後の工程で使用する消化酵素の活性を阻害したり、LC-MS/MSでの分離やイオンの検出に悪影響を与えてしまうことが課題でした。
そのような中、抽出が難しいタンパク質を可溶化しつつ、消化酵素の活性は阻害しない、なおかつ除去が容易である理想的な可溶化剤として、デオキシコール酸ナトリウムを主成分とする相間移動溶解剤 (Phase Transfer Surfactant) が開発されました¹⁾。これを用いた前処理方法はPTS法と名づけられ、膜タンパク質をはじめとする疎水性タンパク質の前処理において多くの実績が報告されています。

1. 

   

2. 

   サンプルから
   タンパク質を抽出

3. 

   酵素による
   タンパク質消化

4. 

   溶液の酸性化と
   攪拌・遠心

5. 

   上層の除去

6. LC-MS/MS

図1 PTS法によるタンパク質抽出文献1)を元に作成

LysoPure™ Protein Extraction-PTS Solutionはプロテオミクスの前処理であるタンパク質抽出で使用する可溶化剤です。相間移動溶解剤 (PTS: Phase Transfer Surfactant) を用いた前処理方法であるPTS法に基づき、抽出が難しいタンパク質を可溶化しつつ、消化酵素の活性は阻害しない、なおかつ液液分配による除去が容易という特性を有しています。本製品は既存の報告^1-2)に改良を加えたPTS溶液であり、これまでのPTS溶液よりもタンパク質の可溶化能とタンパク質消化酵素の活性が高く、さらに消化酵素による切断ミスの発生も低いことが特長です。エクソソームなど細胞外小胞のプロテオミクスにも使用できます。

データ

タンパク質の可溶化能

複数の界面活性剤を混合した異なる組成の各種PTS溶液を用いて、ヒト肝ミクロソーム画分からタンパク質抽出を行い、それぞれのタンパク質濃度を比較した。

[結果]

本製品は他の界面活性剤で構成される従来のPTS溶液よりも、高い可溶化能を示した。

タンパク質消化酵素の活性と切断ミスの発生率

タンパク質消化酵素の活性

PTS溶液	トリプシン			リシルエンドペプチダーゼ (Lys-C)
	PTS溶液の濃度	活性	初速度	PTS溶液の濃度	活性	初速度
SDC+SLS	4 mM	12.6	4.4	4 mM	2.5	1.9
SDC+SC	8 mM	5.7	2.3	8 mM	2.6	2.4
SDC+CDC	8 mM	7.5	4.4	8 mM	2.4	1.8
本製品	8 mM	10.3	4.6	8 mM	2.6	1.8

切断ミスの発生数

PTS溶液	切断ミス発生数
UDC	586
SDC+SLS	723
SLS+SC	273
本製品	291

CDC

ケノデオキシコール酸

SC

コール酸ナトリウム

SDC

デオキシコール酸ナトリウム

SLS

ラウロイルサルコシン酸ナトリウム

UDC

ウルソデオキシコール酸

[結果]

トリプシンの酵素活性はPTS溶液Bが最も高かったものの、切断ミスの発生数も最も多かった。本製品はトリプシンでの酵素活性はPTS溶液Bに劣るものの、リシルエンドペプチダーゼの切断活性は最も高く、切断ミスも少なかった。したがって本製品は酵素活性は高く、切断ミスの発生数が少ないバランスの優れたPTS溶液であることが示唆された。

1. 1）Masuda, T., Tomita, M. & Ishihama, Y.: J. Proteome Res., 7(2), 731(2008).
   Phase transfer surfactant-aided trypsin digestion for membrane proteome analysis
2. 2) Masuda, T. et al.: Mol. Cell. Proteomics, 8(12), 2770(2009).
   Unbiased Quantitation of Escherichia coli Membrane Proteome Using Phase Transfer Surfactants