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多くのがん細胞は、解糖系に依存したエネルギー代謝によりATPを産生しています。一方で、解糖系が抑制されたがん細胞は、ミトコンドリア機能を亢進させることでエネルギー代謝を酸化的リン酸化にシフトさせ生存していることが、近年報告されています。これらの現象を理解することは、抗がん剤のメカニズム解明に役立つだけではなく、老化、神経変性疾患を含む様々な疾患における治療戦略の開発に繋がるため、注目を集めています。
本キットは、解糖能、代謝シフトおよび、細胞が解糖系と酸化的リン酸化のどちらに依存してエネルギー産生を行っているのかをプレートリーダーを用いて評価するキットです。 本キットには、これらの評価に必要な試薬が全て同梱されています。
| コンポーネント | 数量 |
|---|---|
| ・Dye Mixture | ×1本 |
| ・Lactate Standard | 150 μL×1本 |
| ・LDH Solution | 12 μL×1本 |
| ・Lactate Assay Buffer | 5.5 mL×1本 |
| ・Reconstitution Buffer | 550 μL×1本 |
| ・Substrate | ×1本 |
| ・Luciferase Solution | 10 μL×1本 |
| ・ATP Assay Buffer | 5.5 mL×1本 |
| ・Oligomycin | ×1本 |
| ・2-DG | 140 μL×1本 |
使用回数は、行う実験の種類や検討方法によって異なります。
詳細は、Q&A「1キットで測定可能なサンプル数を教えて下さい。」をご確認ください。
本キットは、細胞内のアデノシン三リン酸(ATP)量をホタル・ルシフェラーゼ発光法で測定し、細胞外へ排出される乳酸量をWSTホルマザンを用いた吸光度測定法にて測定するキットです。解糖系と酸化的リン酸化それぞれに対する阻害剤を使用し得られる結果から、代謝経路を評価することが可能です。また、本キットではマイクロプレートを用いた測定が可能です。
Oligomycin で酸化的リン酸化(OXPHOS)でのATP合成を阻害、あるいは、2-Deoxy-D-glucose(2-DG)で解糖系(Glycolysis)でのATP合成を阻害させた時のATP量(発光値)やLactate量(吸光度)の変化を測定することで、次の①～③の評価を行います。
細胞をOligomycinで処理し酸化的リン酸化でのATP合成を阻害した際に、もう一つのエネルギー生成経路である解糖系をどれだけ亢進させることができるかについて、Lactate生成量を指標に評価できます。
解糖系阻害剤(2-DG濃度:2 mmol/l)で処理したHeLa細胞と未処理のHeLa細胞(コントロール)を用いて、解糖能を比較しました。結果、Oligomycinにより酸化的リン酸化でのATP合成を阻害した場合、コントロール細胞は解糖系を亢進させることが可能でしたが、解糖系を阻害した細胞では確かに解糖系を亢進させることが出来ないことを確認できました。
※詳細なプロトコルは、取扱説明書「操作①解糖能の評価」の項目を参照ください。
Oligomycin処理を行った細胞から得られるATP量と未処理の総ATP量から、解糖系およびミトコンドリアでのATP生成量を算出し、これらを指標に細胞が代謝シフトしたかを評価できます。
解糖系阻害剤(2-DG濃度:2 mmol/l)処理によりHeLa細胞が代謝シフトを起こすかどうかを評価しました。結果、コントロール細胞群のATP産生能力は大きく解糖系に依存した結果であったことに対して、解糖系が阻害されたHeLa細胞はATP産生を解糖系から酸化的リン酸化にシフトさせ、ミトコンドリアでのATP産生を増加させることが分かりました。
※詳細なプロトコルは、取扱説明書「操作②代謝シフトの評価」の項目を参照ください。
上記のできる事①②を組み合わせて、細胞の代謝経路依存性を評価することができます。
細胞をOligomycinもしくは2-DGで処理し、酸化的リン酸化もしくは解糖系でのATP合成を阻害した細胞を用いて、それぞれのATP量とLactate生成量を測定します。得られるATP量の変化からエネルギー生産効率を、さらにLactate生成量の変化を見ることで解糖能の変動を確認し、細胞が解糖系と酸化的リン酸化のどちらに依存しているのかを評価できます。
| 2DG | Oligomycin | ATP変動 | 乳酸変動 | ||
|---|---|---|---|---|---|
| コントロール | － | － | |||
| 解凍系阻害 | ＋ | ― | ⬊ | ⬊ | 解糖系依存型 細胞 |
| 酸化的リン酸化阻害 | － | ＋ | ➞ Or ⬈ | ➞ Or ⬈ | |
| 解糖系阻害 | ＋ | － | ⬊ | ⬊ | 酸化的リン酸化 依存型細胞 |
| 酸化的リン酸化阻害 | － | ＋ | ⬊ | ⬊ | |
| 目的の薬剤処理 | ＋ | － | ❓ | ❓ | どちらに 依存している？ |
| － | ＋ | ❓ | ❓ | ||
| ※↑コントロールに対しての変動 | |||||
解糖系阻害剤で処理したHeLa細胞の代謝経路依存性を評価しました。
結果、解糖系阻害処理を行っていない細胞群のATP量は2-DG処理により大きく減少し、Oligomycin処理では変化しません。さらに、Lactate生成量はOligomycin処理により増加しました。このことより、解糖系阻害剤処理なしのHeLa細胞の代謝は解糖系に大きく依存していることが判ります。対して、解糖系阻害処理を行った細胞群は、Oligomycin処理によるLactate生成量の増加がみられず、またATP量がOligomycin処理により大きく減少しました。このことより解糖系を阻害したHeLa細胞の代謝は酸化的リン酸化に依存するようになることが確認できました。
※詳細なプロトコルは、取扱説明書「操作③代謝経路依存性の評価」の項目を参照ください。
細胞老化が誘導されると、SA-β-galの発現亢進や不可逆的な細胞増殖停止といった現象が見られる他、DNAダメージが蓄積した老化細胞では、ミトコンドリア機能の低下によりエネルギー産生を解糖系にシフトします。そこで、A549細胞をDoxorubicinで処理し老化誘導した際のSA-β-gal発現亢進およびエネルギー産生経路(NAD量、ミトコンドリア膜電位、ATP量、Lactate放出量)のシフトを確認しました。
その結果、DNA損傷が認められましたが、SA-β-gal(Senescence Assosiated -β- Galactosidase)産生量が増加し、細胞内 NAD+ 量が低下したことからミトコンドリア膜電位が低下し、エネルギー生産経路が酸化的リン酸化から解糖系へシフトしたことが確認されました。
|
①DNA損傷の蓄積：γH2AX発現亢進 |
③ミトコンドリア機能低下（Complex Ⅰの損傷） |
||
|
②SA-β-gal発現亢進 |
④エネルギー産生：酸化的リン酸化から解糖系にシフト≒解糖系亢進 |
||
使用製品
DNAの損傷：DNA Damage Detection Kit - γH2AX
SA-β-gal発現量：Cellular Senescence Detection Kit - SPiDER-βGal
NAD+量：NAD/NADH Assay Kit-WST
ミトコンドリア膜電位：JC-1 Detection Kit
代謝シフト(ATP量, Lactate放出量)：Glycolysis/OXPHOS Assay Kit (本製品)
多くのがん細胞は解糖系に依存したエネルギー代謝により ATP を産生しています。一方で、解糖系が抑制されたがん細胞はミトコンドリア機能を亢進させることでエネルギー代謝を酸化的リン酸化にシフトさせ生存していることが近年報告されており、細胞種によって代謝経路の依存性が異なります。
２種類のがん細胞(HeLa細胞とHepG2細胞)における酸化的リン酸化と解糖系へのエネルギー産生の依存度合をLactate生成量とATP量およびOCR値より比較しました。
Oligomycin刺激により酸化的リン酸化でのATP合成を阻害、また2-Deoxy-D-glucose(2-DG)により解糖系でのATP合成を阻害した際のATP量とLactate生成量の変化を確認したところ、 HeLa細胞は解糖系に依存し、HepG2細胞は酸化的リン酸化に依存してATP合成している結果が得られました。
使用製品：Glycolysis/OXPHOS Assay Kit (本製品)
同じ細胞数にてミトコンドリア脱共役剤であるFCCP刺激により、細胞の酸素消費を促進した際のOCRを測定しました。
結果、HepG2細胞はHeLa細胞よりもOCR値が高く酸化的リン酸化への依存度が大きいことが示唆され、ATP量やLactate量を指標に評価した場合と相関する結果が得られました。
使用製品：Extracellular OCR Plate Assay Kit (製品コード：E297)
| No. | 対象サンプル | 他の測定指標(試薬) | 引用(リンク) |
|---|---|---|---|
| 1 | 細胞 (RAW264.7) |
H. Gu, Y. Zhu, J. Yang, R. Jiang, Y. Deng, A. Li, Y. Fang, Q. Wu, H. Tu, H. Chang, J. Wen and X. Jiang, "Liver-Inspired Polyetherketoneketone Scaffolds Simulate Regenerative Signals and Mobilize Anti-Inflammatory Reserves to Reprogram Macrophage Metabolism for Boosted Osteoporotic Osseointegration", Adv sci, 2023, doi:10.1002/advs.202302136. | |
| 2 | 細胞 (A549) |
|
L. Z. Liu, B. Wang, R. Zhang, Z. Wu, Y. Huang, X. Zhang, J. Zhou, J. Yi, J. Shen, M. Y. Li and M. Dong, "The activated CD36-Src axis promotes lung adenocarcinoma cell proliferation and actin remodeling-involved metastasis in high-fat environment", Cell Death Dis, 2023, doi:10.1038/s41419-023-06078-3. |
| 3 | 細胞 (イヌ神経膠腫由来細胞株) |
- | H. Yamazaki, S. Onoyama, S. Gotani, T. Deguchi, M. Tamura, H. Ohta, H. Iwano, H. Nishida, P.J. Dickinson and H. Akiyoshi, 'Influence of the Hypoxia-Activated Prodrug Evofosfamide (TH-302) on Glycolytic Metabolism of Canine Glioma: A Potential Improvement in Cancer Metabolism', Cancers, 2023, doi:10.3390/cancers15235537. |
| 4 | 細胞 (primary Hepatocyte) |
|
S. Tsuno, K. Harada, M. Horikoshi, M. Mita, T. Kitaguchi, M. Y. Hirai, M. Matsumoto and T. Tsubo , 'Mitochondrial ATP concentration decreases immediately after glucose administration to glucose-deprived hepatocytes', FEBS Open Bio, 2023, doi:10.1002/2211-5463.13744. |
| 50 tests | ||||||
| Lactate Assay | ATP assay | |||||
| 解糖能 評価 |
代謝シフト 評価 |
代謝経路依存性 評価 |
解糖能 評価 |
代謝シフト 評価 |
代謝経路依存性 評価 |
|
| 96 well プレート | 48 well 分 | 48 well 分 | 48 well 分 | 48 well 分 | ||
| 測定可能なサンプル数 >n=3で行った場合） |
6 サンプル | 4 サンプル | 8 サンプル | 5 サンプル | ||
| 50 tests | ||||||
| Lactate Assay | ATP assay | |||||
| 解糖能 評価 |
代謝シフト 評価 |
代謝経路依存性 評価 |
解糖能 評価 |
代謝シフト 評価 |
代謝経路依存性 評価 |
|
| 96 well プレート | 9 well 分 | 9 well 分 | 21 well 分 | 9 well 分 | ||
| 測定可能なサンプル数 （n=3で行った場合） |
5 サンプル | 4 サンプル | 4 サンプル | 4 サンプル | ||
※予備実験を行った場合の最大測定可能サンプル数を記載しています。
※Lactate Assayを行う際、培地に血清を含む場合、バックグラウンドコントロールとして、使用した血清入り培地のみの測定試料を準備することをお勧めします。
解糖能評価(Lactate Assay)のプレートレイアウト例(n=3)
(左:予備実験無し、右:予備実験あり)
代謝シフト評価(ATP Assay)のプレートレイアウト例(n=3)
(左:予備実験無し、右:予備実験あり)
代謝経路依存性評価のプレートレイアウト例(n=3)
(左:ATP Assay、右:Lactate Assay)(予備実験なし)
代謝経路依存性評価のプレートレイアウト例(n=3)
(左:ATP Assay、右:Lactate Assay)(予備実験あり)
タンパク量でノーマライズする場合は、以下に示す図を参照下さい。
※タンパク量でノーマライズする場合、ATP Assayに使用する試薬の組成上、ATP AssayやLactate Assayに用いた同一細胞サンプルでの評価ができません。そのため、タンパク定量用に別途細胞サンプルをご準備下さい。
必要に応じて
細胞への薬剤刺激
Oligomycin
2-DG
処理
ATP Assay
Lactate Assay
必要に応じて
細胞への薬剤刺激
Oligomycin
2-DG
処理
インキュベート後
上清除去
PBSで洗浄
細胞溶解後
タンパク定量アッセイ
| メーカー | 製品名 | ウェル底 | Cat. No |
|---|---|---|---|
| 住友ベークライト | 発光測定プレート96F 白色 | 白色 | MS-8096W |
| Thermo Scientific | 96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface | 透明 | 165306 |
| SPL Life Sciences | 96ウェル クリアボトムプレート ホワイト/PS | 透明 | SPL-33696 (33696) |
| Greiner | CELLSTAR, μClear, 96ウェル, マイクロプレート, TC (透明底, 低蒸発フタ付, ホワイト, 滅菌, PS) | 透明 | 655098 |
| 製品名 | Glycolysis/OXPHOS Assay Kit | Lactate Assay Kit-WST | ATP Assay Kit-Luminescence | |
|---|---|---|---|---|
| コンポーネント名 | LDH Solution | ⇒ | Enzyme Solution | - |
| Lactate Assay Buffer | ⇒ | Assay Buffer | - | |
| Luciferase Solution | ⇒ | - | Enzyme Solution | |
| ATP Assay Buffer | ⇒ | - | Assay Buffer |
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