同仁化学　トータルROS検出キット

	同仁化学		T社
メーカーコード	R253	R252	-	-
品名	ROS　Assay Kit -Photo-oxidation DCFH-DA-	ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA	D色素	C色素
耐光性 ※観察光による自動酸化	◎ 最も耐光性が高い	× 観察光による自動酸化あり	× 観察光による自動酸化あり	△ 観察光による自動酸化あり
固定化操作	◎ 固定化可能	× 固定化可能	× 固定化可能	〇 固定化可能
感度 （細胞染色時）	〇 既存色素に比べ感度が高い	◎ 最も感度が高い	△ 感度低	△ 感度低

本キットはROSを高感度に検出でき、キット付属のBufferを使って染色することで、より細胞にダメージを与えにくい状態でROSを検出することができます。

製品特長

• トータルROSを高感度に検出
• 蛍光顕微鏡、プレートリーダー、フローサイトメーターで検出可能

既存試薬との比較

活性酸素種に対する反応選択性

Highly Sensitive DCFH-DAは活性酸素種 (ROS) に対して、DCFH-DAと同様の反応性を示します。
また、DCFH-DAと同様の蛍光特性 (λex：505 nm、λem：525 nm) を持つため、同じ励起・蛍光波長での検出が可能です。

検出感度の比較

過酸化水素処理したHeLa細胞 (1 x 10⁴ cells/mL) をDCFH-DAまたはROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-で染色し、細胞内ROSの検出能を比較しました。 結果、いずれの検出装置においてもROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-ではDCFH-DAよりも高感度に細胞内のROSを検出できました。

• ①蛍光顕微鏡での検出

  

  検出条件

  Ex. 488 nm / Em. 500 - 560 nm
  細胞種：HeLa細胞

• ②蛍光プレートリーダーでの検出

  

  検出条件

  Ex. 490 - 520 nm / Em. 510 - 540 nm
  細胞種：HeLa細胞

③フローサイトメーターでの検出

①エラスチン処理した細胞の内在性ROS検出

エラスチン処理により、シスチン / グルタミン酸トランスポーター (xCT) を阻害すると、鉄依存性の細胞死であるフェロトーシスが誘導されることが知られています。エラスチン処理した A549 細胞において、細胞内ROSの変化をイメージングしたところ、エラスチン処理によってROSが増加する結果が得られました。

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実験操作

1. ibidi 8 well plateにA549細胞 (1 x 10⁴ cells, DMEM, 10% fetal bovine serum,1% penicillin-streptomycin) を播種
2. インキュベーター内 (37℃、5% CO₂存在下) で一晩培養
3. 培地を取り除き、DMEM培地で希釈した 50 μmol/l のエラスチンを添加
4. インキュベーター内 (37℃、 5% CO₂存在下) で一晩培養
5. 上清を取り除きHBSSで細胞を2回洗浄後、Highly Sensitive DCFH-DA Dye working solutionを添加
6. インキュベーター内 (37℃、 5% CO₂存在下) で30分間インキュベート
7. Working solutionを除去し、HBSSを用いて細胞を2回洗浄後にHBSSを加え蛍光顕微鏡で観察

②LPS処理したマクロファージの内在性ROS検出

LPS (Lipopolysaccharide) 処理した RAW264.7 細胞において、細胞内ROSの変化をイメージングしたところ、LPS処理によって細胞内のROSが増加する結果が得られました。

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実験操作

1. ibidi 8 well plateに RAW264.7 細胞 (3 x 10⁴ cells, DMEM, 10% fetal bovine serum,1% penicillin-streptomycin) を播種
2. インキュベーター内 (37℃、5% CO₂存在下) で一晩培養
3. 培地を取り除き、HBSSで細胞を2回洗浄後、DMEM培地で希釈した 500 ng/mL のLPSを添加
4. インキュベーター内 (37℃、 5% CO₂存在下)で20時間培養
5. 上清を取り除きHBSSで細胞を2回洗浄後、Highly Sensitive DCFH-DA Dye working solutionを添加
6. インキュベーター内 (37℃、 5% CO₂存在下)で30分間インキュベート
7. Working solutionを除去し、HBSSを用いて細胞を2回洗浄後にHBSSを加え蛍光顕微鏡で観察

③Sulfasalazine (SSZ) による細胞内代謝の変化

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参考文献

1. Shogo Okazaki et al., "Glutaminolysis-related genes determine sensitivity to xCT-targeted therapy in head and neck squamous cell carcinoma". Cancer Sci., 2019, doi:10.1111/cas.14182.

本キットは観察光による自動酸化を抑え、ROS を経時的に高感度に検出することが可能です。

製品特長

• ROS 発生の経時変化の観測が可能
• 細胞内への高い滞留性・高感度化
• 多くの測定装置に対応

技術情報

困難なROS発生の経時変化観察

本キットを用いて染色したRAW264.7 細胞にリポポリサッカリド（LPS）を添加し、マクロファージへの分化誘導によって引き起こされるROSの発生をタイムラプス観察しました。その結果、経時的なROS 産生を観察でき、さらに数値化することができました。

「耐光性」の実現による正確な測定の実現による正確な測定

一般的に活性酸素種の検出には DCFH-DA（または H2DCFDA) が用いられますが、本キットで使用している蛍光色素は観察時の励起光による自動酸化を大幅に抑制しています。

高い滞留性・高感度化の実現
僅かな多様な変化を同時に解析

既存品に比べ、本キットの色素は細胞内での滞留性や蛍光感度を大幅に向上しています。これにより、免疫染色法とや共染色やシングルセルレベルでの解析を実現させ、僅かな ROS 発生や以外の様々なターゲットとの関連性を同時に可視化する事を可能にしました。

免疫染色法との共染色が可能

本キットを用いて染色した HeLa 細胞に過酸化水素を添加後、 Tom20 抗体を用いた免疫染色法との共染色により、ROS 応答とミトコンドリアの形態異常を同時に観察しました。結果、ROS 応答とミトコンドリア形態の状態を鮮明に観察でき、既存色素では困難であった、免疫染色法との共染色ができることがわかりました。

染色後の固定化が可能

一般的に、細胞に固定化処理を行うと細胞内に存在する試薬の多くは細胞外へ漏出します。これは生細胞染色と比べて固定化細胞での ROS 検出が難しくなる要因の一つとなります。本キットを用いて染色した HeLa 細胞に過酸化水素を添加後、PFA で固定化を行い、コントロール細胞と比較をしました。結果、滞留性を高めた本キットは、固定化後もコントロールとの差を維持できることが判りました。

多くの測定装置に対応

活性酸素種を蛍光プレートリーダー、蛍光顕微鏡またはフローサイトメーターで検出することができます。また、DCFH-DA とほぼ同じ蛍光特性（λex=505 nm, λem=525 nm）のため同じ観察波長での検出が可能です。