EV-Save™ 細胞外小胞ブロッキング試薬

• 細胞外小胞を凍結から保護
  細胞外小胞の-80℃保管が可能に！
• 培養上清中および精製後細胞外小胞の実験器具への吸着抑制
  細胞外小胞の回収率がUP！
• サンプルに本製品を添加するだけの簡単操作

＜MagCapture^™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2（Code No. 290-84103）を用いて細胞培養上清から細胞外小胞を単離する場合＞

1. EV-Save^™あるいはin vivo用EV-Save^™を細胞培養上清へ100倍希釈となるように添加し、転倒混和あるいはタッピングで混合する。
2. MagCapture^™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2（V2.0キット）の説明書に記載の“5. 細胞外小胞結合ビーズの洗浄”まで実験を進める。
3. V2.0キットに付属している”Exosome Elution Buffer”にEV-Save^™あるいはin vivo用EV-Save^™を100倍希釈となるように添加し、転倒混和あるいはタッピングで混合する。
4. V2.0キットの説明書に記載の”6. 細胞外小胞の溶出”から実験を再開し、細胞外小胞を溶出する。
5. 溶出した細胞外小胞を保管^※1、もしくは次の実験に進む。

＜他の単離方法を用いて細胞培養上清から細胞外小胞を単離する場合＞

1. EV-Save^™あるいはin vivo用EV-Save^™を細胞培養上清へ100倍希釈となるよう添加し、転倒混和あるいはタッピングで混合する。
2. 単離した細胞外小胞へEV-Save™あるいはin vivo用EV-Save^™を100倍希釈となるように添加し、転倒混和あるいはタッピングで混合する。
3. 細胞外小胞を保管する^※1、もしくは次の実験へ進む。

＜MagCapture^™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2を用いて血清、血漿から細胞外小胞を単離する場合＞

1. MagCapture^™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2（V2.0キット）の説明書に記載の“5. 細胞外小胞結合ビーズの洗浄”まで実験を進める。
2. V2.0キットに付属している”Exosome Elution Buffer”にEV-Save™あるいはin vivo用EV-Save^™を100倍希釈となるように添加し、転倒混和あるいはタッピングで混合する。
3. V2.0キットの説明書に記載の”6. 細胞外小胞の溶出”から実験を再開し、細胞外小胞を溶出する。
4. 溶出した細胞外小胞を保管^※1、もしくは次の実験に進む。

※1 本品を添加していれば-20℃以下での凍結保存が可能です。ただし過度な凍結融解の繰り返しは避けてください

• エクソソーム凍結保護効果　
• チューブに対するエクソソーム吸着抑制効果
• MagCapture^™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2 PSと併用した場合のエクソソーム吸着抑制効果
• ヒトiPS細胞培養上清の限外ろ過時におけるエクソソーム吸着抑制効果
• 細胞（ヒトiPS細胞）毒性評価

エクソソーム凍結保護効果

エクソソームは凍結融解を繰り返すことにより損傷することが知られている ^1）。このようなエクソソームの損傷がEV-Save™の添加により抑制できるかを検討した。

実験条件

PSアフィニティー法^※2対応キットで精製したCOLO201細胞由来エクソソームを凍結融解した。その後、PS Capture™ Exosome ELISA Kit (Anti Mouse IgG POD) (Code No：297-79201) による測定 (A)、および透過型電子顕微鏡 (TEM) による解析を実施した (B)。

※2 ホスファチジルセリン (PS) 結合分子を用いて細胞外小胞を金属イオン依存的に捕捉した後、キレート剤により溶出する方法。MagCapture^™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2の使用により、本手法でのEV精製が行えます。

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参考文献

1. Steffi, B. et al. "Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage", Scientific Reports, 6, 36162 (2016).

チューブに対するエクソソーム吸着抑制効果

EV-Save™を用いて、精製エクソソームのチューブへの吸着抑制効果を調べた。

実験条件

PSアフィニティー法対応キットを用いてCOLO201細胞培養上清からエクソソームを単離した。3 ng/µLに調製したエクソソームをチューブに入れ、3分間静置した。その後別のチューブに移し換え、これを4回繰り返した。「EV-Save™あり」条件は、液量に対し 1/100 希釈となるようEV-Save™を最初に添加し、移し替えた。PS Capture™ Exosome ELISA kit (Anti Mouse IgG POD) (Code No：297-79201) を用いて、エクソソームのCD63シグナルを測定し、移し替え回数によるエクソソームの減少率を調べた。移し替え前のCD63シグナルを100 %として相対値をグラフに示した。

PSアフィニティー法対応キットと併用した場合のエクソソーム吸着抑制効果

TIG3細胞培養上清からPSアフィニティー法対応キットを用いてエクソソームを精製する過程において、EV-Save™の添加によりエクソソームのロスを抑制できるかを調べた。

実験条件

PSアフィニティー法対応キットを用いて、COLO201、TIG3、ヒトiPS細胞の各培養上清1 mLからエクソソームを精製した。限外ろ過による培養上清の濃縮は行わなかった。エクソソーム精製は、「各培養上清へのEV-Save^™添加あり/なし」、「付属の“Exosome Elution Buffer”へのEV-Save^™添加あり/なし」の条件に分けて実施した。

PS Capture™ Exosome ELISA Kit (抗マウスIgG POD) (Code No：297-79201) を使用してエクソソームのCD63シグナルを測定し、エクソソーム量とした。また、細胞培養上清のCD63シグナルを100 %として相対値をグラフに示した。

ヒトiPS細胞培養上清の限外ろ過時におけるエクソソーム吸着抑制効果

細胞（ヒトiPS細胞）毒性評価

in vivo用EV-Save^™とEV-Save^™の比較

アプリケーションデータ

・エクソソームの凍結保護効果

EV-Save^™およびin vivo用 EV-Save^™ をPSアフィニティー法で精製したCOLO201細胞由来エクソソームに添加し、1回もしくは3回凍結融解した。その後、サンプルチューブ内のエクソソーム量をPS Capture^™ Exosome ELISA Kit (ストレプトアビジンHRP) (Code No. 298-80601)により測定した。

・エクソソームの吸着効果抑制

EV-Save^™およびin vivo用 EV-Save^™ をPSアフィニティー法で精製したCOLO201細胞由来エクソソームに添加し、16時間、4℃で保管した。その後、サンプルチューブ内のエクソソーム量をPS Capture^™ Exosome ELISA Kit (ストレプトアビジンHRP) (Code No. 298-80601)により測定した。