定量NMR (qNMR) 用基準物質

内標準物質を選ぶ際には、①測定対象化合物とNMR信号が重ならないこと、②使用する重水素溶媒への溶解性が重要です。以下に当社標準品の¹H NMRチャート^※1、溶解性情報をまとめました。測定対象化合物にあった標準品をご利用ください。

※1 ¹H NMRチャートは条件によって多少変化します。

溶解性情報

qNMR測定で使用する基準物質の品質は、qNMR測定において最も注意しなければいけないポイントのひとつです。qNMRが、医薬品、食品分析を含めた多くの分野で活用され始めている背景としては、信頼性の高い保証値 (純度や濃度など) が付与された基準物質 (例えば、SIトレーサビリティが確保された基準物質) を使用することで、他の分析法と比べて、広範囲な化合物に対し簡便に正確な定量値が得られる点にあります。qNMRが有するこの特性は、裏を返せば、測定結果の基となる基準物質の選定が極めて重要であるということになります。

qNMRに使用する基準物質の選定で注意するポイント^1,2)

• 特異的な領域にケミカルシフトを与えるもの (一般的な有機化合物のシグナルが観測されない領域にケミカルシフトを与えるもの)
• 溶媒への溶解性が良好であるもの
• 安定して精確に秤量できるもの (吸湿性/潮解性や揮発性/昇華性がないもの)
• シグナルの数と、スピン結合によるシグナルの分裂が少ないもの (単一線 (シングレットシグナル) が望ましい)
• 国際単位系 (SI) へのトレーサビリティが確保されたもの (国家標準物質 (National Standard) や認証標準物質 (Certified Reference Material; CRM) など)
  
  • SIトレーサビリティが確保された基準物質を使用することで、SIトレーサブルな定量値 (絶対定量値) を得ることが可能となります。

1,4-BTMSB-d₄標準物質とDSS-d₆標準物質は、上記のポイントを全て満たしており、その汎用性の高さから、日本薬局方において複数品目のqNMR純度規定³⁾に採用されています。論文等で報告されている一般的なqNMR用基準物質のケミカルシフトと、一般的な有機化合物由来シグナルのケミカルシフトを比較すると、1,4-BTMSB-d₄標準物質とDSS-d₆標準物質は、0 ppm付近にシングレットシグナルを与え、他の基準物質と比べて一般的な有機化合物由来シグナルとの分離能が高いことが分かります^3,4)。また1,4-BTMSB-d₄標準物質は有機系の溶媒に良好な溶解性を示し、DSS-d₆標準物質は水系溶媒へ良好な溶解性を示します。

1. JIS K 0138: 2018 定量核磁気共鳴分光法通則　(qNMR通則).
2. Miura T. et al., Analytical standards purity determination using quantitative nuclear magnetic resonance. New Horizons of Process Chemistry: Scalable Reactions and Technologies. (Tomioka K. et al.). Springer, Singapore, 275 (2017).
3. 和光純薬時報　Vol.86 No.1（2018年1月号）
4. Inspired by Dr. Naoki Sugimoto at NIHS.

日本薬局方試薬・試液の項のqNMR純度規定においては、ウルトラミクロ天秤を使用した秤量操作を行いますが、ウルトラミクロ天秤の秤量皿は非常に小さいことから、バイアルなどの容器も小さいものしか載せることができません。そして、この小さいバイアルを秤量皿の上に載せ風袋引きを行い、そのバイアルの中に薬さじなどを使ってサンプルをバイアルの淵などに付着させずに巧く入れるのは非常に困難です。場合によっては、バイアルの外側や、天秤の秤量皿にサンプルが付着し、これに気付かずに測定結果に大きな誤差を生じる可能性があります。そのため、ウルトラミクロ天秤で精確な秤量を行う手法として、アルミニウムなど金属製の秤量皿を風袋として利用する手法が広く利用されています。この手法を利用することで、測定対象物質やqNMR用基準物質をバイアルの淵や、天秤の秤量皿に付着することなく、巧みにバイアルなどの容器の中に入れることが可能となります。

qNMR測定の秤量手順を示します。アルミ秤量皿は、アルミニウム製で帯電しにくく、加えて体積が小さく空気中での浮力の影響を受けにくいことから、qNMR測定での精確な秤量に適しています。また、内容量も80 μLとqNMR測定を実施する上で適度な量を確保しています。さらに、7種の重水素化溶媒（クロロホルム-d、DMSO-d₆、重水、アセトン-d₆、アセトニトリル-d₃、メタノール-d₄、ジクロロメタン-d₂）に対して溶出試験を行い、溶出物由来シグナルが検出されないことを確認しています。本製品は、当社における数百品目を超えるqNMRを利用した試薬製品の品質試験においても実用され、良好な測定結果が得られることが確認されております。また、アルミ秤量皿を投入するのに適した、広口の石英バイアルもご用意しております。

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最小計量値とは、天秤で精確な秤量をする際の採取量の基準のひとつです。qNMR測定の試料調製においては、目標とする測定精度にもよりますが、最小計量値を満たした秤量が推奨されています。製薬業界では、天びんの管理方法の1つとして米国薬局方 (United States Pharmacopeia; USP) General Chapter ＜41＞ Balances及びGeneral Information＜1251＞ Weighing on an Analytical Balancesが広く利用されています^1,2)。測定試料が正確に計量されるためには、天びんがその使用範囲において校正され、かつ以下の基準を満たしている必要があります。

① 繰り返し性は、１つの検査用分銅を10回以上計量して測定すること。
② 計量された値の標準偏差を2倍し、それを使用した分銅の公称値で割った値が0.10％を超えないこと。

これを言い換えると、以下の式が導かれます。

以下に最小計量値の測定例を示します。同じ精度を確保しようとする場合、天秤の最小表示が小さいほど、より少ない採取量で秤量が可能です。

最小計量値の測定例

溶液NMR測定においては、サンプルを重水素化溶媒に溶解し測定に供しますが、使用する重水素化溶媒は、HPLCやGCに用いる一般溶媒と比べて高価であることから、可能な限り使用量を抑えることが求められます。qNMR測定においても、状況は同じであり、濃度固定を前提とした場合、最小表示が小さい天秤ほど、使用する重水素化溶媒の量を節約することができます。実際、日本薬局方では試薬・試液の項の複数品目に、qNMR純度規定が採用されていますが、使用する天秤はすべて「ウルトラミクロ化学はかり^※1を用い」と規定されています。

• 1 最小読み取り値が0.1 μgの天秤 (天秤業界用語ではウルトラミクロ天秤) のこと

1. USP “General Chapter 41 Balances”, USP39-NF34, cited 29 April, (2016).
2. USP “General Information 1251 Weighing on an Analytical Balance”, USP39-NF34, cited 29 April, (2016).

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