DNA免疫法によるモノクローナル抗体作製受託
DNA免疫法による抗体作製の特長
- 精製抗原を調製する必要がありません。
- ネイティブフォームのタンパク質を認識する抗体作製が可能です。
- 複数回膜貫通型タンパク質に対する抗体作製の実績が多数あります。
- ホモロジーの高いターゲットに対する抗体作製が可能です。
DNA免疫法とは？：抗体作製技術
DNA免疫法とは抗体作製方法のひとつです。ターゲット抗原のcDNAを含む発現ベクターを作製し、ベクターを免疫動物に直接投与します。投与されたターゲット抗原のcDNAは、ベクターのプロモーターによって転写され、免疫動物の体内で発現し、免疫原性を獲得します。
従来の抗原（ペプチド・タンパク質）を用いた免疫では取得が難しかった膜タンパク質などに対する抗体も、DNA免疫法では高い成功率を得られています。
当社DNA免疫法受託サービスの優れている点
1. DNA免疫法に最適化した発現ベクターを使用
DNA免疫用に最適化したベクターファミリーから目的に合わせて適切なベクターを選定します。また、いずれの専用ベクターもターゲット抗原が細胞表面に発現し、抗原提示しやすいように設計します。
2. 免疫増強タグの使用
発現させる抗原の免疫原性を高める特殊な配列をベクターに組み込みます。
3. 効率的なDNAデリバリー
免疫動物への免疫方法によっても得られる抗体の性能は変わります。弊社ではベクターの設計だけでなく、免疫方法も最適化しています。
4. Native Form抗原を用いたcell-baseスクリーニング
ターゲット抗原を表面に発現させた細胞を作製し、cell-baseスクリーニングを実施します。
過去のDNA免疫による抗体作製受託サービスにおける実績（～2022年3月末）
当社での受託実績をターゲットタンパク質の種類別に表にまとめました。
全体として、膜タンパク質など従来のタンパク質抗原免疫法では難しいターゲットにおいて、高い抗体取得率を得られています。特に、複数回膜貫通型の膜タンパク質をターゲットとする抗体作製のご依頼を多くいただいています。
| Protein Type / Localization | Projects | 成功率 (%) |
|---|---|---|
| 分泌型タンパク質 | 15/17 | 88.2 |
| 膜タンパク質 （タイプⅠ型） | 55/59 | 93.1 |
| 膜タンパク質 （タイプⅡ型） | 3/5 | 60.0 |
| 膜タンパク質 （GPI-アンカー型） | 6/6 | 100 |
| 膜タンパク質 （複数回膜貫通型） | 48/64 | 75.0 |
| 細胞内、核タンパク質 | 5/6 | 83.3 |
| ウイルス由来タンパク質 | 2/3 | 66.7 |
| Total success rate: | 134/160 | 83.8 |
※マウス・ラットのみの実施
DNA免疫法による抗体取得の原理
通常のモノクローナル抗体作製方法では、DNA情報から組み換えタンパクを調製するか、ペプチドを合成し、それらを抗原として免疫動物へ投与して抗体を取得します。
一方、DNA免疫法は、プラスミドを直接免疫動物へ投与し、免疫動物の体内でターゲットタンパク質を発現させ、免疫を惹起します。 従来のタンパク質・ペプチド免疫法と比べ、「抗原タンパク質・ペプチドが不要」「抗原のコンタミネーションが起こらない」「抗原変性が起こらない」「ターゲット抗原の改変が容易」といったメリットがあります。
中和抗体（機能性抗体）を得られやすい点も特徴のひとつです。
DNA免疫法で取得した抗体とアプリケーション
DNA免疫法で作製された抗体の実験アプリケーションには向き不向きがあります。 DNA免疫法によって得られる抗体は、ネイティブフォームの非変性タンパク質を認識するため、非変性タンパク質の検出に適しています。例えば、プルダウンアッセイ、ELISA、フローサイトメトリー、抗体アレイです。治療・診断を視野に入れた抗体取得にも向いています。
しかしながら、変性タンパク質抗原は認識しないケース多いため、還元条件におけるウエスタンブロット用抗体としては適していません。SDS-PAGEにおける還元剤の作用によって、サンプル中のタンパク質が変性するため、DNA免疫法で得られる「タンパク質のネイティブな立体構造を認識する抗体」が反応しなくなります。
DNA免疫法受託サービスの流れ・価格（免疫動物：マウス・ラット）
Feasibility Study抗体作製戦略の立案
ご依頼いただいた配列情報や使用目的を元に、ターゲットの構造および性質を分析し、抗体作製戦略を提案させていただきます。
具体的には、弊社の持つin-house発現ベクターの中から、ターゲットの構造及び性質を踏まえた最適なベクターを選択し、最適な免疫領域及び免疫方法、スクリーニング方法を報告書と共に提案させていただきます。
| 抗体作製戦略の立案 | 希望納入価格 | 納期 |
|---|---|---|
| Feasibility Study | 95,000円 | 2週間 |
Milestone 1哺乳細胞における抗原の発現解析
細胞表面での発現確認：上記Feasibility Studyで決定した内容に基づき、ターゲット遺伝子をin-house発現ベクターにクローニングし、免疫プラスミドを作製いたします。それを用いてターゲットの細胞表面での発現レベルを一過性強制発現細胞を用いてフローサイトメーターを用いて評価します。このステップでの発現レベルが、Milestone 2（免疫）への移行の重要な判断材料となります。このベクターにはあらかじめtag配列が含まれており、発現確認には抗tag抗体を用いてターゲットの発現レベルを確認いたします。
| 試験名 | 希望納入価格 | 納期 |
|---|---|---|
| 哺乳細胞における抗原の発現解析 | 500,000円 | 1.5ヵ月 （cDNA合成の納期は含まれません） |
※1 複数回膜貫通タンパク質以外のターゲット
※2 DNA合成を当社で実施する場合は別料金となります。
Milestone 2マウス・ラット免疫
動物への免疫：作製した免疫用プラスミドを動物に免疫いたします。免疫方法は皮下免疫です。６～１０週間にわたって免疫を行なった後に抗血清を回収します。抗体価をMilestone 1で作製した一過性強制発現細胞を用いてフローサイトメーターで評価します。また、抗血清は個体ごとに回収し、オプションでお客様へ評価用サンプルとしてお送りします。なお、この解析の際に用いる発現ベクターは、免疫に用いたものとは異なるtag配列が挿入されているものを用いるため、tagに対する抗体価は除外されますので、特異抗体価を測定することになります。
| マウス・ラット免疫 | 動物※ 3 | 希望納入価格 | 納期 | |
|---|---|---|---|---|
| Premium Course | マウス | 12匹 | 1,500,000円 | 2か月～ |
| ラット | ９匹 | |||
| Standard Course | マウス | 10 匹 | 1,250,000円 | 2か月～ |
| ラット | 6 匹 | |||
| Basic Course | マウス | 3匹 | 1,000,000円 | 2か月～ |
| ラット | 3匹 | |||
※3 マウス=BALB/c、ラット = Wistarの場合の価格。それ以外の系統になる場合は、別途追加料金がかかります。
オプション
| 内容 | 希望納入価格 |
|---|---|
| お客様所有の細胞株によるFCM解析 | 150,000円/株 |
| 免疫動物の匹数追加 | 30,000円/匹 |
| 抗血清サンプル送付 | 30,000円/回 |
| リンパ節細胞ストックの作製※4 | 400,000円 |
※4 Milestone 3へ移行する場合は100,000円となります。
Milestone 3モノクローナル抗体の作製
Cellベースのスクリーニング：モノクローナル抗体のスクリーニングは、一過性強制発現細胞を用いたフローサイトメトリーとCell-ELISAによる解析を行います。場合によってはお客様ご指定の細胞を用いて、解析作業/スクリーニングを実施いたします。なお、本スクリーニングに用いる発現ベクターもMilestone 2血清解析時に用いたものと同様、免疫に用いたものとは異なるtag配列が挿入されているものを用いるため、tagに対する抗体は除外されます。
最終的には、特異的反応性を示すハイブリドーマ細胞とその培養上清3mLを納品させていただきます。
| ハイブリドーマの樹立 | 条件 | 希望納入価格 | 納期 | |
|---|---|---|---|---|
| Premium Course | 細胞融合プレート | 10枚 | 3,600,000円 | 2ヶ月～3ヶ月 |
| クローニング | 6クローン | |||
| Standard Course | 細胞融合プレート | 5枚 | 3,000,000円 | 2ヶ月～3ヶ月 |
| クローニング | 6クローン | |||
| Basic Course | 細胞融合プレート | 3枚 | 2,500,000円 | 2ヶ月～3ヶ月 |
| クローニング | 2クローン | |||
オプション
| 内容 | 希望納入価格 |
|---|---|
| 細胞融合プレート枚数追加 | 60,000円/枚 |
| クローニングの追加 | 100,000円/クローン |
| 培養上清の送付（24ウェル、6ウェルプレートの段階） | 30,000円/回 |
Milestone-4抗体遺伝子の取得
樹立したハイブリドーマを増殖後、mRNAを抽出し、cDNAを合成します。5’RACE法により、H鎖とL鎖の両方で抗体遺伝子の可変領域を増幅させ、抗体発現用カセットベクターへクローニングします。哺乳細胞で一過性発現させた培養上清を、フローサイトメトリーで抗原結合性試験を行います。抗原結合性が確認できた陽性クローンを、シーケンシングと遺伝子配列解析を行い、抗体遺伝子情報を取得します。
納品物は、抗体遺伝子情報、抗体遺伝子（ベクター）、培養上清、報告書になります。
| 試験名 | 希望納入価格 | 納期 |
|---|---|---|
| 抗体遺伝子の取得 | 800,000円/クローン | 約2ヵ月 |
DNA免疫法受託サービスの流れ・価格（免疫動物：ウサギ）
ウサギ抗体のモノクローナル化は、技術的な理由から困難とされてきました。特に、モノクローナル抗体作製のゴールデンスタンダードである細胞融合法の効率が悪いことが技術的な壁になっていました。当社は、細胞融合法ではなく、富士フイルムグループ独自技術（特許番号：WO2024071374）を加えたB-cell screening技術を導入することで、効率的にウサギモノクローナル抗体作製を可能にしました。
DNA免疫法をウサギモノクローナル抗体とかけ合わせることで、両者の特長を持つ「高機能性×高親和性」抗体の取得が期待できます。抗体医薬や診断薬に向けた次世代抗体としてご利用ください。
Feasibility Study 抗体作製戦略の立案
ご依頼いただいた配列情報や使用目的を元に、in silicoでターゲットの構造および性質を分析し、抗体作製戦略を提案させていただきます。
加えて、最適な免疫領域及び免疫方法、スクリーニング方法も報告書と共に提案させていただきます。
| 試験名 | 希望納入価格 | 納期 |
|---|---|---|
| Feasibility Study （抗体作製戦略の立案） |
95,000円 | 2週間 |
Milestone-1 哺乳細胞における抗原の発現解析
細胞表面での発現確認：上記Feasibility Studyで決定した内容に基づき、ターゲット遺伝子をお客様からご提供いただいたベクター、または当社in-house発現ベクターにクローニングし、免疫プラスミドを作製いたします。哺乳細胞に一過性発現後、フローサイトメーターにより細胞表面での抗原の発現をチェックします。
既に発現することがわかっているベクターがございましたら、Milestone1を省略することが可能です。
エクソソームの発現確認：Milestone-3のB-cell screeningに使用する細胞外小胞（エクソソーム）の発現確認を行います。一過性発現後の培養上清をエクソソーム精製キットで回収し、ELISAまたはフローサイトメトリーにより、エクソソーム表面での抗原の発現をチェックします。
| 試験名 | 希望納入価格 | 納期 |
|---|---|---|
| 哺乳細胞における抗原の発現解析 | 1,000,000円 | 1.5ヶ月 （cDNA合成※の納期は含まれません） |
※ DNA合成を当社で実施する場合は別料金となります。
Milestone-2 ウサギ免疫
動物への免疫：作製した免疫用プラスミドをウサギに免疫いたします。免疫方法は皮下免疫です。2ヵ月程にわたって免疫を行なった後に抗血清を回収します。抗体価をMilestone-1で作製した一過性強制発現細胞を用いてフローサイトメーターにより評価します。また、抗血清は個体ごとに回収し、オプションでお客様へ評価用サンプルとしてお送りします。
また、動物実験の第三者認証・非認証施設の選択が可能です。
| Milestone-2（ウサギ免疫） | 希望納入価格 | 納期 |
|---|---|---|
| Premium Course（第3者認証対応※1） | 2,500,000円 | 2ヶ月～ |
| Standard Course（第3者認証非対応） | 1,000,000円 | 2ヶ月～ |
※ ウサギ=日本白色種の場合の価格。それ以外の系統になる場合は、別途追加料金が発生します。
※1 AAALAC International（国際実験動物ケア評価認証協会）認証施設
オプション
| 内容 | 希望納入価格 |
|---|---|
| 免疫動物の羽数追加（4羽以上） | お問い合わせください |
| 追加免疫（3羽） | お問い合わせください |
| お客様所有の細胞株によるFCM解析 | 150,000円/株 |
| ELISAによる評価 | 100,000円/抗原 |
| 抗血清サンプル送付 | 30,000円/回 |
| 脾臓回収・送付 | 400,000円/羽 |
| エクソソームELISA※1 | 500,000円 |
※1 抗血清を使用
Milestone-3 B-cell cloningによるモノクローナル抗体作製
B-cell cloning：抗体価が上昇したウサギ個体の脾臓を採取し、脾細胞を取得します。脾細胞を約20万個の穴（チャンバー）を持つプレートに播種し、細胞を1つずつ分離します。お客様で採取した脾細胞をお送りいただき、Milestone-3から実施することも可能です。
スクリーニング：1次スクリーニングは、脾細胞を播種したチャンバー内で実施します。チャンバー内に抗原を膜上に発現させた細胞外小胞（エクソソーム）を塗布することで、膜タンパク質でもスクリーニングを行うことを可能にしました（特許番号：WO2024071374 ）。抗原に結合する抗体を分泌する細胞をピックし（最大44細胞）、1-cell PCRにより抗体遺伝子を増幅させます。2次スクリーニングでは、増幅した遺伝子断片で哺乳細胞に簡易発現させ、フローサイトメトリーまたはELISAにより抗原結合性を確認します。オプションで、培養上清をお送りし（～数百μL）、お客様で評価いただくことも可能です。
クローニング：6クローンを選択いただき、抗体遺伝子を搭載した発現ベクターを構築します。発現ベクターを用いて、哺乳細胞に一過性発現させ、フローサイトメトリーまたはELISAにより抗原結合性と発現量を解析します。その後、抗体遺伝子をシーケンスし、抗体遺伝子配列と発現ベクターを納品いたします。
膜タンパクのスクリーニング技術
可変領域増幅
PCR断片での組換え抗体の抗原結合性確認
ベクターでの組換え抗体の抗原結合性確認
| 試験名 | 希望納入価格 | 納期 |
|---|---|---|
| B-cell cloningによるモノクローナル抗体作製 | 4,000,000円 | 2～3ヶ月 |
※1次スクリーニングで使用する抗原（リコンビナントまたはペプチド）を頂ける場合、3,500,000円になります。
※1次スクリーニングで陽性細胞が20個未満の場合、500,000円で追加プレートによるスクリーニングをさせていただきます。
オプション
| 内容 | 希望納入価格 |
|---|---|
| 追加プレートによるスクリーニング （1次スクリーニングで陽性細胞が20個未満） | 500,000円/回 |
| 追加プレートによるスクリーニング （1次スクリーニングで陽性細胞が20個以上） | 2,000,000円/回 |
| 培養上清の送付（2次スクリーニング後） | 100,000円 |
| クローニング数の追加（7クローン以上） | 500,000円/クローン |
| ELISAによるスクリーニングの追加（2次スクリーニング） | 100,000円/抗原 |
| ELISAによるスクリーニングの追加（クローニング） | 100,000円/抗原 |
お見積り・ご注文について
よくある質問
取得される抗体について
- DNA免疫法によって得られた抗体はウエスタンブロッティングにも用いる事ができますか
- 遺伝子免疫で作製した抗体はネイティブフォームの抗原を認識していますので、変性タンパクには反応しない場合も多くあります。リニアなエピトープを認識する抗体が得られれば、ウェスタンに使用も可能ですが、得られるタンパク質に依存します。
- どのようなアイソタイプの抗体が取得されるのでしょうか
- 免疫動物の系統にもよりますが、マウスBalB/cの場合、IgG1が最も多く、IgG2a, 2bが取得される場合もあります。ラットWIstarの場合は、IgG2a, 2bが最も多く、IgG1が取得される場合もあります。
- 中和活性やADCC活性のある抗体は得られるのでしょうか
- 多くの実績はありますが、全てのプロジェクトで成功したわけではない旨、ご理解ください。
- 立体構造、指定した特定の領域を認識する抗体はできますか
- DNA免疫法では立体構造を認識する抗体が主に取得されます。また、ターゲットタンパク構造にもよりますが、指定した特定領域に対する抗体作製が可能な場合もありますのでご相談下さい。
- 作製された抗体の権利は誰が所有するのでしょうか
- 確立されたハイブリドーマを含め、全てお客様に帰属します。
- すでに周知の抗体とは異なるエピトープに対する抗体が欲しいのですが、取得可能ですか
- ターゲットの性状に応じて、競合がかからない抗体をスクリーニングすることが可能です。ターゲットに応じたストラテジーをご提案いたしますので、お気軽にご相談ください。
作業工程について
- 免疫動物は何を用いているのですか
- 基本的に、マウス(BalB/c)・ラット(Wistar)を用いています。また、経験上、ラットの方が抗体価が上がりやすいことが分かっているため、ラットをより推奨しています。
過去にTGマウス、KOマウス等に免疫してモノクローナル抗体を作製した実績もあります。
- 抗体作製工程の中で、ユーザー評価を行えるでしょうか
- ご希望であれば、中間サンプルをご評価いただき、結果を反映したハイブリドーマクローン選抜等を行うことも可能です。
抗原について
- 遺伝子配列情報しかもっていないのですが、クローニングは行ってもらえますか
- クローニングは基本的に行っていません。遺伝子配列情報をもとに、cDNA合成を45円～/bp（合成する長さによって価格は異なります）で承っています。
- どのくらいのサイズのターゲットまで作製可能でしょうか
- 小さいものは約50アミノ酸(aa)、大きいものでは約1,000aa程度のターゲットタンパクの抗体作製に成功した実績があります。実際の受託では、個々のターゲットタンパク構造等に応じ、適した免疫領域をご提案しております。
- 掲載内容は本記事掲載時点の情報です。仕様変更などにより製品内容と実際のイメージが異なる場合があります。
- 掲載されている製品について
- 【試薬】
- 試験・研究の目的のみに使用されるものであり、「医薬品」、「食品」、「家庭用品」などとしては使用できません。
- 試験研究用以外にご使用された場合、いかなる保証も致しかねます。試験研究用以外の用途や原料にご使用希望の場合、弊社営業部門にお問合せください。
- 【医薬品原料】
- 製造専用医薬品及び医薬品添加物などを医薬品等の製造原料として製造業者向けに販売しています。製造専用医薬品(製品名に製造専用の表示があるもの)のご購入には、確認書が必要です。
- 表示している希望納入価格は「本体価格のみ」で消費税等は含まれておりません。
- 表示している希望納入価格は本記事掲載時点の価格です。