Exolitus社 ExoPLANT

ExoPLANT-Hi Kit は、水分の多い果実、葉、根など、高水分の新鮮な植物材料から完全なエクソソームを簡便に濃縮できます。

• エクソソームは新鮮な材料からのみ分離可能です
• 膜構造を破壊する可能性のある植物抽出物やその他の調製物からは、完全なエクソソームを分離することはできません

キット以外にご用意いただくもの

プロトコル

サンプル調製

1. 植物材料から新鮮なしぼり汁を調製する。
2. しぼり汁の体積を測定する。
3. 植物材料から抽出したしぼり汁を遠心チューブに移す。
4. 適切な量の Stabilizing Agent A を加える。しぼり汁 10 mL あたり Stabilizing Agent A 0.5 g が必要。
5. ボルテックスでよく混合する。
6. 遠心分離によりパルプを除去する。：
   ①混合物を 2 ℃ ~ 8 ℃ で1000 x g、5分間遠心分離する。
   ②上清を新しい遠心チューブに移す。
   ③上清を 2 ℃ ~ 8 ℃ で10,000 x g、10分間遠心する。
   ④上清を新しい遠心チューブに移す。
   ⑤パルプが除去され上清が透明になるまで、上清の遠心分離を繰り返す。

エクソソームの単離

7. 上清を滅菌済みの 0.22 μm 孔径フィルターで濾過する。
8. 濾過した上清の体積を滅菌済みのピペットまたはメスシリンダーで測定する。
9. 濾過した上清に Exosome Collecting Agent B (sterile) を体積比1:1で添加する。
   注：試薬は粘性がある。気泡混入を防ぐため、ピペッティングは極めてゆっくり行う
10. 溶液が均一になるまでよく混合する。
11. 混合物を 2 ℃ ~ 8 ℃ で一晩、または 10 時間以上インキュベートする。
12. 混合物を 2 ℃ ~ 8 ℃ で 3000 x g、60 分間遠心分離する。
13. 上清をすべて除去する。
14. エクソソームを PBS または同等の緩衝液で再懸濁する。
    注：エクソソームは植物固有の pH で保存した際に最も安定する。
15. 分離したエクソソームは、-20 ℃で最大 3 か月、-80 ℃ で最大 6 ヶ月保存可能。

ExoPLANT-Lo Kit は、水分含有量が低い（多汁性ではない）または水分を含まない植物材料から完全なエクソソームを簡便に濃縮できます。
ExoPLANT-Lo によるエクソソーム分離に適した植物材料は、生鮮、乾燥、凍結乾燥、または凍結状態のものとなります。

• 膜構造を破壊する可能性のある植物抽出物やその他の調製物からは、完全なエクソソームを分離することはできません

キット以外にご用意いただくもの

プロトコル

サンプル調製

1. 植物材料を計量する。
2. 植物材料をすり鉢に移す。
3. すりこぎを用いて材料を粉末状に粉砕する。植物材料が粉砕しにくい場合は、すり鉢に少量の液体窒素を加え、粉砕を続ける。
4. 表に記載の比率に基づき、植物材料の量に対応する Stabilizing Agent A および Exosome Release Solution B の必要量を計算する。：

   植物材料	Stabilizing Agent A	Exosome Release Solution B
   1 g	0.5 g	10 mL

5. Stabilizing Agent A を加え、計算した量の Exosome Release Solution B を植物材料が入った乳鉢に注ぐ。
6. 乳棒を用いてサンプルを完全に混合する。
7. 混合物を遠心チューブに移す。
8. 差速遠心分離によりパルプを除去する。：
   ①混合物を 2 ℃ ~ 8 ℃ で 1000 x g、5 分間遠心分離する。
   ②上清を新しい遠心チューブに回収する。
   ③上清を 2 ℃ ~ 8 ℃ で 10,000 x g、10 分間遠心する。
   ④上清を新しい遠心チューブに回収する。
   ⑤パルプが除去され上清が透明になるまで上清の遠心を繰り返す。

エクソソームの単離

9. 上清を滅菌済みの 0.22 μm 孔径フィルターでろ過する。
10. 滅菌済みピペットまたはメスシリンダーを用いて、ろ過した上清の体積を測定する。
11. ろ過した上清に Exosome Collecting Agent C を 1:1 の体積比で添加する。
    注：Exosome Collecting Agent C は粘性があり、長期保存後に層状分離を起こす可能性があるため、使用前に容器を5～7回程度軽く逆さにして混合すること。ピペッティングは気泡混入を防ぐため、非常にゆっくり行うこと。
12. 溶液が均一になるまでよく混合する。
13. 混合物を 2 ℃ ~ 8 ℃ で一晩（少なくとも 10 時間）インキュベートする。
14. 混合物を 2 ℃ ~ 8 ℃で 3000 x g、60分間遠心分離する。
15. 上清をすべて除去する。
    注：エクソソームペレットを損傷させずに可能な限り上清を除去するよう注意してこの手順を実施すること。過剰な上清残留は、エクソソーム特性の下流解析に干渉する可能性がある。
16. エクソソームを PBS または同等の緩衝液で再懸濁する。
    注：エクソソームは、植物固有の pH で保存すると最も安定する。
17. 分離したエクソソームは、-20 ℃ で最長 3 か月、-80 °C で最長 6 ヶ月保存できる。

方法

製品データシートに基づき 0.45 μm フィルターを用いて凍結乾燥キノコ粉末 1g の抽出を行った。Ev は PBS 0.2 mL に再懸濁した。

ナノ粒子トラッキング解析

得られた粒子の濃度	1.07×1011/mL
得られた総粒子数	4.13×1011