dsRNA ELISAキット

検量線範囲	UTP dsRNA : 7.7 – 1,000 pg/mL m1ψ dsRNA : 15.4 – 2,000 pg/mL
測定対象	dsRNA (二本鎖RNA)
測定対象サンプル	mRNA溶液
測定時間	約4.5時間
検出法	発色法 (主波長 450 nm / 副波長 620 nm)

検量線例

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本製品は、サンドイッチELISAでdsRNAの検出を行うキットです。
測定プレートの各ウェルには抗dsRNA抗体 clone：J2が固相化されており、このウェルに標準溶液またはサンプルを加えます。
その後、ビオチン標識抗dsRNA抗体 clone：J2とペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを反応させます。

さらに、ウェルに残ったペルオキシダーゼをTMB溶液と反応させて、発色法による測定でdsRNAを測定することができます。

キット構成

構 成 品	容　量
抗体固相化プレート	96 wells (8×12) /1枚
UTP dsRNA標準品	50 μL/本
m1ψ dsRNA標準品	50 μL/本
サンプル反応用緩衝液	25 mL/1本
抗体反応用緩衝液	25 mL/1本
ビオチン結合抗体	1本
ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン溶液	120 μL/1本
TMB溶液	12 mL/1本
反応停止液	12 mL/1本
洗浄液 (10×)	100 mL/1本
プレートシール	4枚

測定プロトコル

Step 01

試薬の調製
キット構成部材の標準品、洗浄液を希釈調製します。

Step 02

サンプルの調製
任意のサンプルを希釈調製します。

UTP mRNAサンプルはmRNA 100 ng/mL以下、m1ψ mRNAサンプルはmRNA 500 ng/mL以下となるように濃度調整を行うことを推奨します。また、検量線範囲に収まるようにサンプル濃度を調整してください。

Step 03

反応操作

①　抗体固相化プレート	3回洗浄
②　サンプルまたは標準溶液	100 μL添加 500 rpmで攪拌、20℃～25℃、2時間反応 ＊ビオチン結合抗体からビオチン結合抗体溶液の調製 (精製水120 μL で溶解後、室温化した抗体反応用緩衝液で100 倍に希釈してください。)
③　抗体固相化プレート	3回洗浄
④　ビオチン結合抗体溶液	100 μL添加 500 rpmで攪拌、20℃～25℃、1時間反応
⑤　抗体固相化プレート	3回洗浄
⑥　ペルオキシダーゼ結合 　　 ストレプトアビジン溶液	100 μL添加 500 rpmで攪拌、20℃～25℃、1時間反応
⑦　抗体固相化プレート	3回洗浄
⑧　TMB溶液	100 μL添加 600 rpmで攪拌、10秒間 × 3回 攪拌後静置、20℃～25℃、30分反応
⑨　反応停止液	100 μL添加 600 rpmで攪拌、10秒間 × 3回

Step 04

吸光度測定
プレートリーダーで主波長450 nm、副波長620 nmを測定します。

修飾核酸、鎖長の影響

固相 ： K1 検出： K2

固相 ： J2 検出： K2

固相 ： J2 検出： J2

本製品の抗体組み合わせの検出系 (固相：J2、検出：ビオチン化J2) と、その他のdsRNAを認識する抗体クローンの組み合わせについて、それぞれUTP, m1ψ修飾のdsRNA標準品を使用し、さまざまな鎖長の濃度1 ng/mLのdsRNAを比較測定した。
その結果、本製品の検出系は、m1ψ修飾の有無や鎖長に関わらず、最も検出濃度の変動が少なく測定できた。

mRNA溶液中のdsRNAの測定

本製品を使用して、Cap構造を有する非修飾mRNAおよびm1ψ修飾mRNA溶液中にdsRNAを添加し、希釈後検出を行った。
その結果、非修飾mRNAの場合は、20 ng/mLから100 ng/mLの濃度範囲において、m1ψ修飾のmRNAの場合は、50 ng/mLから500 ng/mLの濃度範囲において、測定値がmRNAサンプル濃度に比例して、直線性を示すことを確認した。

添加回収試験

UTP mRNA

mRNA (ng/mL)	dsRNA添加量 (pg/mL)	dsRNA測定値 (pg/mL)	回収率 (%)
200	500	637	92
	100	285	109
	20	197	104
	0	176	-
50	500	550	101
	100	140	96.5
	20	64	100
	0	44	-

m1ψ mRNA

mRNA (ng/mL)	dsRNA添加量 (pg/mL)	dsRNA測定値 (pg/mL)	回収率 (%)
200	500	638	94.1
	100	280	113
	20	186	93
	0	167	-
50	500	521	95.9
	100	145	104
	20	60	95.7
	0	41.1	-

本製品を使用して、mRNA溶液中でdsRNAの添加回収試験を行った。
その結果、50 ng/mLおよび200 ng/mLにおいて、高い添加回収効率を示した。

IVT反応後のmRNA溶液中dsRNAの測定

他社製品 in vitro transcription (IVT) キットAおよびBを使用して、長鎖長と短鎖長の2種類のmRNAを合成した。
その後、本製品を使用してmRNA中に含まれるdsRNAの検出を行った。
その結果、非修飾mRNAの場合は、25 ng/mLから100 ng/mLの濃度範囲において、m1ψ修飾のmRNAの場合は、125 ng/mLから500 ng/mLの濃度範囲において、測定値がmRNAサンプル濃度に比例して、直線性を示すことを確認した。

マトリックスの影響

本製品と他社製品について、合成反応前のIVT溶液にdsRNAを添加した時の添加回収率を比較した。
本製品は他社製品よりもマトリックスの影響が無く、希釈無しでもdsRNAを測定できた。