ニッポンジーン　HeatAct LAMP MASTER シリーズ

マスターミックスにプライマーと鋳型核酸を添加するだけの簡単操作

LAMP 法に必要な耐熱性鎖置換型DNAポリメラーゼ、Mg²⁺、dNTPs、至適化されたバッファーなどを含むため、2 x LAMP MASTERにプライマーと鋳型核酸を添加するだけでLAMP法によるDNA増幅を行うことができます。
(テンプレートDNA調製方法について実験例はこちら)

反応液調製時の非特異的増幅を抑制

DNAポリメラーゼに特異的に結合するアプタマーにより、室温～50℃での酵素活性を抑制し、反応液調製時における非特異的増幅やプライマーダイマー形成を低減します。60 - 68℃でアプタマーが解離して酵素が活性化され、特異性の高い等温増幅が可能です。
(反応特異性について実験例はこちら）
(50℃でのDNAポリメラーゼ活性抑制について実験例はこちら)

ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）に対する高い阻害耐性

本製品はSDSに対する耐性をもつため、SDSを含む簡易抽出液から得られた粗抽出核酸を鋳型として用いた場合でも、DNAの増幅が期待できます。 (実験例はこちら)

逆転写酵素を添加し、RT-LAMP可能

RT-LAMPにおける50℃での逆転写反応など、柔軟な反応設計に対応します。逆転写酵素は別途ご用意ください。 (実験例はこちら)

テンプレートDNA調整方法の実験例

血液試料およびシロイヌナズナから、下記2種類の方法で調製したDNA溶液を鋳型として、本製品 (HeatAct LAMP Master for Fluorescence) を用いてLAMP反応を行った。テンプレートDNAの調製方法の違いがLAMP反応に及ぼす影響について比較検討した。

比較に使用したDNA抽出用試薬

簡易DNA抽出試薬「Template Prepper for DNA」 (コードNo.：316-08911)
別途調製したSDS含有の「簡易抽出液」 (組成：10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1% SDS, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM DTT)

結果
HeatAct LAMP Master for Fluorescenceを用いることで、SDSを含む簡易抽出液で調製したDNAを鋳型とした場合においても、血液および植物試料のいずれからもLAMP反応による増幅が確認された。
一方、抽出方法および試料種によってCq値に差が認められたことから、試料対象に応じた前処理条件の最適化が有用である可能性が示された。

ニッポンジーン DNA抽出試薬について詳しくはこちら

RT-LAMP (1 Step / 2 Step) 条件の比較

Total RNAを鋳型とし、AMV Reverse Transcriptase を添加した以下の反応液組成にて RT-LAMP を実施した。 65℃で 1時間反応させる 1 Step 条件と、逆転写酵素の至適温度に近い 50℃で10分間逆転写反応を行った後、65℃で 1時間反応させる 2 Step 条件を設定し、それぞれ 6 well で比較した。

反応条件

① 1 Step RT-LAMP ： 65℃ 1時間 (逆転写反応・LAMP反応)
② 2 Step RT-LAMP ： 50℃ 10分間 (逆転写反応)、65℃ 1時間 (LAMP反応)

結果
50℃、10分の逆転写ステップ追加により、鋳型RNA量が少ない条件においてRT-LAMPの再現性および感度が向上した。
Total RNA 鋳型量が 20 pg/well の場合、1 Step RT-LAMP に比べ、2 Step RT-LAMP では増幅のばらつきが低減した。また、Total RNA 鋳型量が 2 pg/well の条件では、1 Step RT-LAMP では 6 well 中 6 well すべてで増幅が認められなかったのに対し、2 Step RT-LAMPでは 6 well 中 3 well で増幅が確認された。

反応特異性

反応特異性について評価するため、陽性コントロールプラスミドを添加したLAMP反応液 (PC) および鋳型なしのLAMP反応液 (NTC) を調製し、25℃で2時間保温した後、65℃で1時間反応させた。本製品 (HeatAct LAMP Master for Fluorescence) および従来品 (LAMP Master for Fluorescence) について同一条件下で比較した。測定にはLight Cycler^® 96を使用した。

結果
HeatAct LAMP Master for Fluorescenceは、反応液調製時の非特異的増幅およびプライマーダイマー形成を低減した。
アプタマーを含まない従来品では、25℃、2時間のNTC条件下において非特異的増幅が確認された。一方、HeatAct LAMP Master for Fluorescenceはアプタマーの効果により、同条件下においても非特異的増幅産物は検出されなかった。

50℃でのDNAポリメラーゼ活性抑制

陽性コントロールプラスミドを添加したLAMP反応液 (PC) および鋳型なしのLAMP反応液 (NTC) を、以下の反応条件でLAMP反応を行った。アプタマーを含む他社製品 (約45℃までの酵素活性を抑制) と本製品 (約50℃までの酵素活性を抑制) とで比較した。

反応条件

① 65℃ 1時間 (LAMP反応)
② 50℃ 1時間の保温後、65℃ 1時間 (LAMP反応)

結果
HeatAct LAMP Master for Fluorescenceは、他社製品と比較して高い温度 (約50℃) まで酵素活性を効果的に抑制した。
HeatAct LAMP Master for Fluorescenceは、①および②の条件で同等の増幅が確認された。一方、他社製品では②の条件において、50℃保温中にDNAの増幅が進行したため、65℃での反応においてCq値は測定不能となり、さらにNTC条件において非特異的増幅が認められた。

SDS耐性評価

本製品

「HeatAct LAMP MASTER for Fluorescence」(コードNo. 311-09821)

従来品

「LAMP MASTER for Fluorescence」(コードNo. 317-08941)

他社製品

マスターミックス試薬(蛍光検出用)

結果
HeatAct LAMP Master for FluorescenceはSDSに対して高い耐性を示し、SDS終濃度0.2%存在下においても増幅が認められた。 一方、従来品および他社製品では、SDS終濃度0.01%の条件においても増幅は認められなかった。
HeatAct LAMP Master for FluorescenceはSDS含有核酸抽出試薬から得られた粗抽出核酸を鋳型として使用できることがわかった。