ニッポンジーン　LAMP法用核酸増幅試薬　LAMP MASTERシリーズ

LAMP MASTER for Fluorescence と AMV Reverse Transcriptase による RT-LAMP (One Step)

HeLa細胞から ISOSPIN Cell & Tissue RNA (製品コード：314-08211) を用いて total RNA を抽出し、鋳型 RNA として使用した。2 x LAMP MASTER、10 x Intercalation Mix、プライマーセット (標的領域：GAPDH) に逆転写酵素である AMV Reverse Transcriptase (製品コード：311-07501) を追加して混合した反応液を調製し、リアルタイム PCR 装置で増幅から検出までの工程をワンステップで行った。

反応条件

2 x LAMP MASTER	12.5 µL
10 x Intercalation Mix	2.5 µL
10 x LAMP Primer Mix	2.5 µL
AMV Reverse Transcriptase	0.2 units (1 µL)※
鋳型RNA	0.5, 5, 50 ng (1 µL)
ddWater	up to 25 µL
68℃　60 min → 融解曲線解析	装置：LightCycler® 96

• ニッポンジーン製品 AMV Reverse Transcriptase (20 units/μL) を 0.2 units/μL になるよう希釈してから反応系に添加。

結果

鋳型RNAを0.5 ng添加した場合も、15分以内に増幅を確認できた。

LAMP MASTER for Turbidity (Visible Dye) による目視判定例

Q：RNAを鋳型にしたDNA増幅 (RT-LAMP法) は可能ですか？

A：反応系にAMV Reverse Transcriptaseを添加していただくことで可能になります。

濁度検出に使用できる装置は？

A：エンドポイント濁度測定装置 LT-16 (製品コード: NE4011) などが使用可能です。

Q：蛍光検出に使用できる装置は？

A：リアルタイムPCR装置などが使用可能です。

Q：目視判定に使用できるUV 照射装置は？

A：240-260 nm あるいは 350-370 nm の範囲の波長を出力するUV 照射装置が使用できます。

Q：10 x Intercalation Mixを添加したあと、DNA増幅を濁度測定装置で検出できますか？

A：10 x Intercalation Mixは、インターカレーターと耐熱性ピロホスファターゼを含むため、ピロリン酸の生成による不溶物質 (白濁) の形成は起こりません。濁度測定装置では検出できませんので、リアルタイムPCR装置などの蛍光検出用装置をご利用ください。

Q：25 x Visible Dyeを添加したあと、DNA増幅を濁度測定装置で検出できますか？

A：可能ですが、濁度測定の場合と目視判定の場合とで推奨のLAMP反応時間が異なります。反応時間を長くすることも可能ですが、その場合、陰性コントロールで非特異反応がないことを確認してください。