ニッポンジーン LAMP法用核酸増幅試薬 LAMP MASTERシリーズ
「LAMP MASTER for Turbidity」(2 x LAMP MASTER) は、LAMP 法による等温核酸増幅のためのマスターミックス試薬です。LAMP 法に必要な耐熱性鎖置換型 DNA ポリメラーゼ、 Mg2+、dNTPs、至適化されたバッファーなどを含むため、2 x LAMP MASTER にプライマーと鋳型核酸を添加するだけで LAMP 法による DNA 増幅を行うことができます。
検出方法に合わせて試薬を選択
濁度検出
2 x LAMP MASTERのみを用いる場合、反応液の濁度を測定し増幅を検出できます。
蛍光検出
セット品付属のインターカレーターを添加することにより、リアルタイムPCR装置で検出できます。
目視判別
セット品付属の蛍光目視試薬を添加することにより、増幅を目視で確認することできます。
使用例
LAMP MASTER for Fluorescence と AMV Reverse Transcriptase による RT-LAMP (One Step)
HeLa細胞から ISOSPIN Cell & Tissue RNA (製品コード：314-08211) を用いて total RNA を抽出し、鋳型 RNA として使用した。2 x LAMP MASTER、10 x Intercalation Mix、プライマーセット (標的領域：GAPDH) に逆転写酵素である AMV Reverse Transcriptase (製品コード：311-07501) を追加して混合した反応液を調製し、リアルタイム PCR 装置で増幅から検出までの工程をワンステップで行った。
反応条件
| 2 x LAMP MASTER | 12.5 µL |
| 10 x Intercalation Mix | 2.5 µL |
| 10 x LAMP Primer Mix | 2.5 µL |
| AMV Reverse Transcriptase | 0.2 units (1 µL)※ |
| 鋳型RNA | 0.5, 5, 50 ng (1 µL) |
| ddWater | up to 25 µL |
| 68℃ 60 min → 融解曲線解析 | 装置：LightCycler® 96 |
- ニッポンジーン製品 AMV Reverse Transcriptase (20 units/μL) を 0.2 units/μL になるよう希釈してから反応系に添加。
結果
鋳型RNAを0.5 ng添加した場合も、15分以内に増幅を確認できた。
LAMP MASTER for Turbidity (Visible Dye) による目視判定例
Q & A
Q：RNAを鋳型にしたDNA増幅 (RT-LAMP法) は可能ですか？
A：反応系にAMV Reverse Transcriptaseを添加していただくことで可能になります。
濁度検出に使用できる装置は？
A：エンドポイント濁度測定装置 LT-16 (製品コード: NE4011) などが使用可能です。
Q：蛍光検出に使用できる装置は？
A：リアルタイムPCR装置などが使用可能です。
Q：目視判定に使用できるUV 照射装置は？
A：240-260 nm あるいは 350-370 nm の範囲の波長を出力するUV 照射装置が使用できます。
Q：10 x Intercalation Mixを添加したあと、DNA増幅を濁度測定装置で検出できますか？
A：10 x Intercalation Mixは、インターカレーターと耐熱性ピロホスファターゼを含むため、ピロリン酸の生成による不溶物質 (白濁) の形成は起こりません。濁度測定装置では検出できませんので、リアルタイムPCR装置などの蛍光検出用装置をご利用ください。
Q：25 x Visible Dyeを添加したあと、DNA増幅を濁度測定装置で検出できますか？
A：可能ですが、濁度測定の場合と目視判定の場合とで推奨のLAMP反応時間が異なります。反応時間を長くすることも可能ですが、その場合、陰性コントロールで非特異反応がないことを確認してください。
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