抗腸内細菌抗体

ヒトの腸内には細菌をはじめとするさまざまな種類の微生物が存在しており、生息環境に適応した多様なマイクロバイオータ (腸内細菌叢) を形成しています。マイクロバイオータの構成や代謝産物はがん、糖尿病、肥満、アレルギー、神経精神疾患などさまざまな疾患に関与することが報告されており、ヒトの健康との関連が注目されています。
特に日本人に多く存在する腸内細菌としてフォカエイコラ・ブルガタス、フィーカリバクテリウム・ダンカニエ、セガテラ・コプリなどが知られています。これらの細菌の構成比を調べ、腸内細菌叢のエンテロタイプを特定することで、対象の腸内環境を理解することができます。このような腸内細菌の解析は主に次世代シークエンス (NGS) が利用されていますが、労力やコストが課題となっています。
国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 國澤 純 先生、吉井 健 先生らの研究グループは迅速・安価で簡便な腸内細菌の検出法の開発に取り組み、上記の腸内細菌を認識するモノクローナル抗体を開発しました¹⁾。それぞれの細菌をマウスに直接免疫するノンターゲット戦略により各種細菌を認識することができます。

当社では以下3種類の腸内細菌に対する抗体をラインアップしています。

腸内細菌	フォカエイコラ・ブルガタス (Phocaeicola vulgatus)			フィーカリバクテリウム・ダンカニエ (Faecalibacterium duncaniae)			セガテラ・コプリ (Segatella copri)
細菌の概要	旧名 バクテロイデス・ブルガタス (Bacteroides vulgatus)。代謝や免疫機能をサポート。通常は共生菌だが、特定条件下で病原性を示す。本属に関する研究は、腸内細菌叢による健康維持や疾患予防に繋がることが期待されている。			旧名 フィーカリバクテリウム・プラウスニッチ(Faecalibacterium prausnitzii)。ヒトや動物の腸内に生息する嫌気性細菌。短鎖脂肪酸を生成することが知られており、潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸疾患への関連などが報告されている。			旧名 プレボテラ・コプリ (Prevotella copri )。さまざまな部位に生息するグラム陰性細菌。歯周病、炎症性腸疾患、細菌性膣炎などに関連する可能性が示唆されている。
コードNo.	013-28931	010-28941	017-28951	012-28901	019-28911	016-28921	014-28961	011-28971
クローンNo.	PV-L2B7-117K1	PV-L1A6-117K2	PV-S10F7-14K1	FD-S2D3-18K1	FD-L4F6-18K2	FD-L5B6-33K2	SC-S10C3-49K1	SC-L10B5-35K1
サブクラス	IgG2b	IgG2b	IgG3	IgG2b	IgG2b	IgG2b	IgG2a	IgG2a
免疫動物	マウス
組成	1 x D-PBS、0.05% アジ化ナトリウム
アプリケーション	ELISA (ダイレクト/サンドイッチ※)、フローサイトメトリー、免疫沈降、ウエスタンブロッティング

サンドイッチELISAによる各種腸内細菌の定量とNGS (16S rRNA遺伝子) との比較

ヒト糞便 3検体について、抗腸内細菌抗体を組み合わせたサンドイッチELISAにより菌数を測定した。またサンドイッチELISAとNGSによる16S rRNA遺伝子のアンプリコンシークエンスで得られた腸内細菌の構成比を比較した。

サンドイッチELISAの構成

(1) P. vulgatus
捕捉抗体: PV-L1A6-117K2
検出抗体: PV-L2B7-117K1

(2) F. duncaniae
捕捉抗体: FD-S2D3-18K1
検出抗体: FD-L4F6-18K2

(3) S. copri
捕捉抗体: SC-S10C3-49K1
検出抗体: SC-S10C3-49K1

腸内細菌数の測定 (サンドイッチELISA)

• Phocaeicola vulgatus
• Faecalibacterium duncaniae
• Segatella copri

NGS (16S rRNA遺伝子) との比較

• Phocaeicola vulgatus
• Faecalibacterium duncaniae
• Segatella copri

ELISA

96ウェルマイクロプレートに細菌溶液100 μLを添加し、コーティングした。細菌溶液は凍結乾燥した熱殺菌細菌をPBSで希釈する、もしくはB-PER溶液に懸濁し、ガラスビーズで破砕することで調製した。抗原固相化プレートのブロッキングおよび洗浄を行った後、ハイブリドーマ 各クローンの細胞培養上清を添加し、2時間インキュベートした。抗原に結合した抗腸内細菌抗体はHRP標識ヤギ抗マウスIgGを用いて検出した。

• P. vulgatus
• F. duncaniae
• S. copri
• B. pseudocatenulatum
• B. longum
• B. wexlerae
• A. muciniphila

フローサイトメトリー

ヒト腸内細菌に対する各クローンの反応性

細菌をファーマー固定液 (エタノール:酢酸=7:3) で固定後、遠心分離(13,040 x g, 2分, 4 °C) を行った。細菌 100 μLと抗腸内細菌抗体 1 μgを1% BSAを含むPBS-Tに懸濁し、氷上で1時間インキュベートした。細胞を洗浄後、FITC標識抗マウスIgGを添加し、30分間、氷上、暗所で反応させた。染色された細菌を洗浄し、フローサイトメーターで解析した。

Anti-P. vulgatus

Anti-F. duncaniae

Anti-S. copri

データは著作者の許諾を得て、文献1)を元に作成

混合培養系の菌種解析

従来、複数菌種を共培養した場合、培養後に各菌種を区別して解析することは困難であった。しかし、菌種特異的な抗体を用いることで、クロスフィーディングを考慮した食品成分、抗菌物質、プレバイオティクス、培地などの評価に有用な解析系を構築できる。

実験フロー (例)

①2種類の腸内細菌 (P. vulgatus (Pv)、F. duncaniae (Fd)) をそれぞれYCFA培地で培養する。

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②PvおよびFdを8：2の割合で混合する。
（この時、Pvのうち30％を固定し、Fdのうち50％を固定した。）

↓

③それぞれの菌を認識する抗体を蛍光標識し、それぞれ抗Pv抗体 (AF488標識) および抗Fd抗体 (AF647標識) を用意する。固定菌に対してはヨウ化プロピジウム (PI) を添加することで蛍光標識される。

使用抗体：
F. duncaniae (Fd) : クローン No.FD-S2D3-18K1 (コードNo. 012-28901)
P. vulgatus (Pv)：クローン No.PV-L2B7-117K1（コードNo. 013-28931）

抗体濃度条件：
3×10⁷〜1.2×10⁸の細菌に対し、抗Fd抗体は50 µg/mL、抗Bv抗体は100 µg/mLを100 µL添加した。

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④フローサイトメトリーによって測定することで、複数菌種が混合した状態でも各菌種を識別することが可能。さらに各菌種でゲーティングし、PI等のviability dyeと組み合わせることで菌種ごとの生存率を同時に評価することも可能である (下図) 。

＜データ提供＞国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 　國澤先生

ウエスタンブロッティング

各腸内細菌を10,000 x gで5分間 遠心分離して回収後、タンパク質 2 µgをSDS-PAGEにて分離した。分離したタンパク質はPVDF膜に転写し、ブロッキング後、25-50 ng/mLの抗腸内細菌抗体およびHRP標識マウスIgGを用いて検出した。

サンプルは以下、腸内細菌の抽出液を使用
P. vulgatus : Phocaeicola vulgatus JCM5826
F. duncaniae : Faecalibacterium duncaniae JCM31915
S. copri : Segatella copri JCM13464

データは著作者の許諾を得て、文献1)を元に作成

免疫染色

平板培地コロニーの菌種同定

複数菌種を共培養した後に菌種の単離を行う場合には、平板培地にコロニーを形成させ、コロニーPCR等による菌種同定が必要である。この際、同一コロニー中に複数の菌種が混在していることもあり、注意が必要である。
しかし、菌種特異的抗体を用いることで、コロニーを染色するだけで目的菌種を迅速かつ簡便に識別可能である。

プロトコル (例)

①「培養」

腸内細菌3種類 (F. dancaniae (Fd), P. vulgatus (Pv), S. copri (Sc)) をYCFA寒天培地上で嫌気培養し、コロニーを形成させた。

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②「コロニーの転写」

平板培地上に形成されたコロニーをピックし、スライドグラス上に塗布した。

↓

③「室温乾燥」

塗布後、スライドグラスを室温で十分に乾燥させた。

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④「菌体固定」

スライドグラス上に塗布した菌体を室温で十分に乾燥させた後、塗布面を上にしてスライドグラスの裏面を火炎で加熱し、菌体を固定した(2〜３往復)。60℃でヒートブロック上に2分間静置でも同様の結果が得られる。

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⑤「染色（室温で5分）」

各菌種に対する一次抗体は、濃度1 mg/mLの抗体100 µL（抗体量100 µg）を用い、Thermo Fisher ScientificのAntibody Labeling Kitを使用して、製造元のプロトコールに従い蛍光標識した。標識反応後、キット付属の精製カラムを用いて未反応の蛍光色素を除去し、蛍光標識抗体を回収した。

使用抗体：
F. duncaniae (Fd) : Clone No.FD-L4F6-18K2 (コードNo. 019-28911)
P. vulgatus (Pv): Clone No. PV-S10F7-14K1 (コードNo. 017-28951)　
S. copri (Sc): Clone No. SC-L2B11-62K1 （該当製品なし）

使用抗体標識キット：
Antibody Labeling Kits for 100 μg (Thermo, A88062, A88065, A88068)

精製した各蛍光標識抗体を0.5%スキムミルク in PBSで50倍（1:50）に希釈し、スライドグラス上にゆっくりと滴下後室温、遮光下で5分間反応させた（大きさによるが一箇所のコロニー部分につき約10-50 µL 滴下）。染色後、PBSを用いて洗浄し、スライドグラスを室温で乾燥させた。

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⑥「観察」

封入剤とカバーグラスをのせ、乾燥後の標本を蛍光顕微鏡で観察した (下図)。蛍光標識された菌種特異的抗体を用いることで、同一コロニー中にFd、Pv、Scの菌種が混在していることが視認できた。各菌種特異的なプライマーを用いたコロニーPCRの結果との整合性も取れていた。

＜データ提供＞国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 　國澤先生

1. Yoshii, K. et al.: Sci. Rep., 15(1), 1(2025).
   Establishment of enterotype-specific antibodies for various diagnostic systems