CTGF ELISAキット

結合組織成長因子(CTGF: Connective Tissue Growth Factor)は臍静脈や血管内皮細胞から産生される約38 kDaの分泌タンパク質です。細胞接着や軟骨細胞の増殖・分化などに関与することが知られているほか、組織線維化の主要因子と考えられており、線維症のマーカー候補として報告されています。

当社ではCTGFの全長および全長+N末領域を測定するELISAキットをそれぞれ開発しました。2種類のELISAを組み合わせることで特発性肺線維症 (IPF)のバイオマーカーとして期待される血液中のN末領域CTGFを正確に測定することが可能です。

CTGFとは?
CTGF ELISAキットワコー
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CTGFとは?

CTGF (Connective Tissue Growth Factor) は臍静脈と血管内皮細胞から産生される約38kDa の分泌タンパク質です。CCN (Cyr61/CTGF /Nov)ファミリーの1種であり、CCN2とも呼ばれます。CTGFは主にModule 1 - Module 4 の4つの部位から構成されており、Module 1 はIGF 結合ドメイン、Module 2 はVWC ドメイン、Module 3 はTSP-1 ドメイン、Module 4 はCT ドメインと呼ばれ、それぞれのドメインに異なる因子が結合することで機能します。

CTGFは組織線維化において重要な役割を果たしており、線維症のバイオマーカー候補として報告されています。CTGFはTGFβによって発現が誘導され、細胞外基質を産生する筋線維芽細胞の分化やコラーゲンの合成を促進することで線維化に関与しています¹⁾。マウスの皮膚線維化においては、TGFβが線維化の発症に、CTGFは線維化の持続にそれぞれ重要であることが示されています²⁾。その他にもCTGFは軟骨細胞の増殖や分化、細胞間接着などに関与することが報告されています。

CTGFには全長CTGFの他に、Module 2 － Module 3間の切断で生じるN末領域 (Module 1-2) のCTGFとC末領域 (Module 3-4)のCTGFがあります。CTGF (C末領域)は分解を受けやすく、血中には主にCTGF (全長)とCTGF (N末領域)が存在すると考えられています。CTGF (N 末領域)は特発性肺線維症 (IPF: Idiopathic Pulmonary Fibrosis)のバイオマーカーとして期待されているものの³⁾、CTGF(全長)とCTGF (N末領域)が混在するなかで、CTGF (N末領域)のみを測定することは困難でした。

CTGF ELISAキットワコー

当社ではCTGFの全長および全長+N末領域を測定するELISAキットをそれぞれ開発しました。2種類のELISAを組み合わせることで、特発性肺線維症 (IPF)のバイオマーカーとして期待される血液中のN末領域CTGFを正確に測定することが可能です⁴⁾。

製品ラインアップ

品名	CTGF(全長) ELISAキットワコー	CTGF(全長＋N末領域) ELISAキットワコー
コードNo.	290-84701	292-84901
測定対象	CTGF（全長）	CTGF（全長）およびCTGF（N末領域）
測定原理
検体	ヒト血清、ヒト血漿（EDTA） ※ ヘパリン血漿は非推奨 ※ マウスの血清・血漿は測定不可
検量線範囲	7.81 - 500 pM
必要検体量	ヒト血清: 5 μL、ヒト血漿（EDTA）: 10 μL
測定時間	2時間50分
検出法	発色

性能データ

全長、N末断片、C末断片との交差性

各ELISAキットについて、CTGFの全長、N末断片、C末断片それぞれとの交差性を確認した。

[結果]
CTGF(全長) ELISAキットワコーはCTGFの全長を、CTGF(全長+N末領域) ELISAキットワコーはCTGFの全長とN末断片を特異的に測定できた。

CCNファミリーとの交差性

CTGFを含むCCNファミリーとの交差率(500 pM, n=8)を確認した。

	CTGF ELISA （全長）交差率 (%)	CTGF ELISA （全長+N末領域）交差率 (%)
CCN1	<0.5	N.D.
CCN2 （CTGF）	100	100
CCN3	<0.5	N.D.
CCN4	<0.5	N.D.
CCN5	<0.5	N.D.
CCN6	<0.5	N.D.

N.D. = 未検出

[結果]
当社キットはCCNファミリーの中で、CCN2(CTGF)に高い特異性を示した。

各社キットにおけるCTGF反応性の比較

濃度既知のヒトCTGFリコンビナントタンパク質(rHuman CTGF) ① 全長、② N末領域、③ C末領域をそれぞれ段階希釈し、各社キットで測定した。測定手順は各社キットの取扱説明書に従った。

CTGFへの反応性
	① rHuman CTGF(全長）	② rHuman CTGF(N末領域）	③ rHuman CTGF(C末領域）
CTGF(全長＋N末領域) ELISAキットワコー	＋	＋	－
CTGF(全長) ELISAキットワコー	＋	－	－
R社キット	＋	－	N.D.
M社キット(N末領域)	－	－	－

＋: 反応する、－: ほとんど反応しない、N.D.: 未検出

[結果]
CTGF(全長＋N末領域) ELISAキットワコーはCTGF(全長)およびCTGF(N末領域)に、CTGF(全長) ELISAキットワコーはCTGF(全長)にそれぞれ高い反応性を示した。
R社キットはCTGF(全長) にのみ高い反応性を示した。M社キット(N末領域)は当社で検討したいずれのCTGFにもほとんど反応しなかった。

アプリケーションデータ

N末領域CTGFの測定 (希釈直線性試験)

段階希釈したヒト血清もしくはヒト血漿(EDTA)を用いて、CTGF(全長＋N末領域)ELISAキットワコーでCTGFの全長+N末領域を、CTGF(全長) ELISAキットワコーでCTGFの全長を測定した。さらにその差分からN末領域CTGFの量を求め、希釈直線性を確認した。

検体	希釈倍率	CTGF（全長＋N末領域）（pM）	CTGF（全長）（pM）	CTGF（N末領域） (pM）
ヒト血清	1/1	1735	952	783
	1/2	875	495	380
	1/4	417	237	180
ヒト血漿 (EDTA)	1/1	684	126	558
	1/2	347	66.2	281
	1/4	157	34.9 * 参考値	122

[結果]
本手法で求めたCTGF（N末領域）量について、高い希釈直線性があることが確認できた。

健常者およびIPF患者の血漿におけるN末領域CTGFの測定

健常者および特発性肺線維症(IPF)患者より採取した血漿(EDTA)から、CTGF(全長＋N末領域)ELISAキットワコーとCTGF(全長) ELISAキットワコーを用いて、CTGF (全長)およびCTGF (N末領域)の量を求めた。

健常者
ID	CTGF（全長＋N末領域） (pM)	CTGF（全長） (pM)	CTGF（N末領域） (pM)
1	494	83.4	411
2	535	116	419
3	580	155	425
4	661	129	532
5	383	63.5	319
	mean	109	421
	SD	36.4	75.6

IPF患者
ID	CTGF（全長＋N末領域） (pM)	CTGF（全長） (pM)	CTGF（N末領域） (pM)
1	1226	213	1013
2	1004	187	817
3	432	35.4	397
4	1422	278	1144
5	938	39.9	898
6	682	73.2	609
7	1123	168	955
8	849	45.5	804
9	857	60.6	796
	mean	122.3	826
	SD	90.3	221

[結果]
CTGF(全長)は健常者とIPF患者の間で統計的に有意な差は見られなかった。一方、IPF患者の血漿中CTGF (N末領域) 量は健常者よりも有意に高かった。

参考文献

Biernacka, A., Dobaczewski, M., and Frangogiannis, N. G.: Growth Factors, 29(5), 196(2011).
TGF-β signaling in fibrosis
Mori T., et al.: J. Cell Physiol., 181(1), 153(1999).
Role and interaction of connective tissue growth factor with transforming growth factor-beta in persistent fibrosis: A mouse fibrosis model.
Kono, M. et al.: Clin. Chim. Acta, 412, 2211(2011).
Plasma CCN2 (connective tissue growth factor; CTGF) is a potential biomarker in idiopathic pulmonary fibrosis (IPF)
Miyazaki, O. et al.: Ann. Clin. Biochem., 47, 205(2010).
Subtraction method for determination of N-terminal connective tissue growth factor

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