PS Capture™ Exosome ELISA Kit

• 特長

  • 高感度定性および定量解析
    検体中の細胞外小胞を直接測定可能 (単離不要)
    2.5 μL相当の血液検体から細胞外小胞を検出 (検体の節約)
    WB法より50~1000倍高感度 (微量マーカーの検出)
  • 幅広いアプリケーション
    培養上清や血液検体中細胞外小胞の定性・定量解析
    EV-depleted FBS中残存細胞外小胞の確認
    レクチンを用いたエクソソームの糖鎖解析
  • ビオチン標識による幅広い検出系
    様々な動物種由来の抗体やレクチン等を用いた検出へ対応
  • 簡便な操作と高い再現性
    細胞外小胞の検出用にキットと試薬を最適化

• 測定原理

  

  細胞外小胞表面のホスファチジルセリン(PS) と特異的に結合するタンパク質Tim4を固相化したプレートに細胞外小胞を反応させて固定化した後、任意の細胞外小胞表面マーカータンパク質に対するビオチン標識抗体を一次検出に、キット付属のHRP 標識ストレプトアビジンを二次検出に用いることで、任意のマーカータンパク質を表面に有する細胞外小胞を高感度に検出することができます。

アプリケーションデータ

血液検体および細胞培養上清検体の希釈直線性(Linearity)

COLO201細胞培養上清から精製した細胞外小胞を用いて作成した標準曲線をもとに、①ヒト血清希釈検体、②ヒトヘパリン血漿希釈検体、③ヒトEDTA血漿希釈検体(各2検体, 4段階希釈)および ④COLO201細胞培養上清の4段階希釈検体におけるエクソソーム濃度測定(CD63検出)を行い、各サンプルにおける希釈直線の評価を行った。

• ①血清

  

• ②ヘパリン血漿

  

• ③EDTA血漿

  

• ④COLO201細胞培養上清

  

PS Affinity法と抗体法の比較 (Capture Ability)

前処理済み^※1の各細胞培養上清を、抗CD抗体(CD9, CD63, CD81)およびTim4それぞれが固相化されたマイクロプレートの各ウェルに添加し反応させた。次に、結合したエクソソームを各ビオチン標識抗CD抗体(CD9, CD63, CD81)を用いて検出した。

※1 前処理条件: 10,000 x g, 30分

• iPSC(希釈率 1:20)

  

• COLO201(希釈率 1:500)

  

• HEK293T(希釈率 1:100)

  

COLO201由来精製エクソソームの添加回収試験【EpCAM】

COLO201細胞培養上清からMagCapture™ Exosome Isolation Kit PS (製品コード：293-77601)を用いて単離・精製したエクソソームを前処理済み^※2プール正常ヒト血清、EDTA血漿およびヘパリン血漿それぞれに添加した。各濃度で添加したサンプル中のエクソソームについて、ビオチン標識抗EpCAM^※3抗体(MBL社)を用いて検出した後、COLO201細胞由来精製エクソソームを用いた標準曲線をもとに、各サンプル中に添加されたエクソソームの回収率を算出した。

※2 前処理条件: 10,000 x g, 30分
※3 EpCAM：Epithelial Cell Adhesion Molecule

EV-depleted FBS中残存細胞外小胞の確認

未処理FBS、市販のEV-depleted FBSおよび超遠心処理FBS (UC-treated FBS)^※4中に残存する細胞外小胞をビオチン標識抗CD9抗体^※5を用いて検出した。

Capture: Tim4 / Detection: ビオチン標識抗CD9抗体

※4 超遠心条件: 160,000xg, 16時間
※5 抗CD9抗体 (Code No. 014-27763)にBiotin Labeling Kit-SH (Code No. 348-90941)を用いて標識した。

糖鎖解析への応用: Tim4とrBC2LCNレクチンを用いたサンドイッチELISA

前処理済み^※6の5倍希釈iPS細胞培養上清中のエクソソームについて、ビオチン標識抗CD63抗体 (製品コード：019-27713)およびビオチン標識rBC2LCNレクチン※7を用いて検出した。

Capture: Tim4 / Detection: 各ビオチン標識体

※6 前処理条件: 10,000 x g, 30分
※7 ヒトES細胞およびiPS細胞の未分化マーカーとして使用され、Fucα1-2Galβ1-3GalNAc(GlcNAc)を認識します。
rBC2LCN (Code No. 029-18061)をEZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin (ThermoFisher社)を用いて標識した。

ポリマー沈殿法との回収効率比較

前処理済み^※8 COLO201 細胞培養上清 1 mL からPS アフィニティー法(PS)およびポリマー沈殿法(他社品A)でエクソソームを単離・精製した後、PS Capture™ Exosome ELISA Kit (Streptavidin HRP) を使用してエクソソームマーカーであるCD63 のシグナルを測定した。得られた各サンプルの吸光度から、単離後のサンプルに残存するエクソソームと回収エクソソームの回収効率を比較した。

回収効率の計算方法

インプット: 100 倍希釈培養上清の測定値を使用^※Ⅰ
残存エクソソーム: 精製後の100 倍希釈培養上清の測定値を使用^※Ⅰ
回収エクソソーム: 1,000 倍希釈した精製サンプルの測定値を使用^※Ⅱ

※Ⅰ 100 倍希釈が測定範囲に入ることを確認しています。事前検討にて使用サンプルごとにELISA 測定における適正希釈率を算出してください。
※Ⅱ 本キットおよびポリマー試薬で精製したエクソソームは10 倍濃縮されています。(eg. インプット: 1 mL →精製エクソソーム: 100 μL) よって、濃縮倍率にELISA 希釈率を乗じた値が、精製エクソソームサンプルのELISA 測定における希釈倍率になります。

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