1細胞レベルでの解像度で解析を実現

CUBIC Trial Kit

データ提供元:
国立研究開発法人理化学研究所
洲﨑悦生先生、上田泰己先生

CUBIC Trial Kitは、透明化技術であるCUBIC(Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)で使用する試薬のキットです。
本法は上田泰己先生、洲崎悦生先生らによって開発されました。
キットに含まれる溶液に組織を浸漬するだけでマウス脳・全組織、霊長類の全脳、甲殻類の全組織の透明化および屈折率調整が可能です。
本法は病理学的アプローチや1細胞レベルでの観察への応用が期待されています。

CUBIC 引用・使用文献リスト 100報以上掲載!
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CUBIC特長

  • 操作が簡単(溶液に浸漬するだけ)
  • 臓器を丸ごと透明化
  • マウス全脳を2週間で透明化可能

透明化可能組織

マウス脳・全組織、霊長類の全脳、魚類・甲殻類・甲虫などの全組織、骨 (脱灰処理が必要)

CUBIC Trial Kit キット構成

  1. ScaleCUBIC-1 Solution 250 mL x 1本
  2. ScaleCUBIC-2 Solution 250 mL x 1本
  3. Mounting Solution-1 40 mL x 1本
  4. Mounting Solution-2 40 mL x 1本

透明化に必要なもの

試薬
  1. CUBIC Trial Kit
  2. パラホルムアルデヒド (製品コード160-16061)
  3. 1×PBS (製品コード164-25511)
器具
  1. 5 mL/15 mL/30 mL/50 mL コニカルチューブ (サンプルに合わせて使用)
  2. シーソーシェーカー
  3. CUBIC透明化標本向け蛍光顕微鏡と推奨対物レンズ※※
  • 共焦点顕微鏡、2光子顕微鏡、ライトシート顕微鏡
  • ※屈折率(RI=1.49)に合った対物レンズをご用意ください。
    データ取得前にお手持ちの顕微鏡メーカーに確認することを推奨いたします。

CUBICプロトコル

組織透明化プロトコル例(臓器丸ごと)

組織透明化プロトコルにおいてはサンプルサイズにより、使用する試薬量、処理時間が変わるので注意が必要です。また、サンプルはできるかぎり灌流固定後に摘出・再固定してください。

各工程使用試薬量の目安は 12 - 15 mL です。洗浄は 5 - 10 倍量を目安に使用ください。

*2日ごとに新しい溶液に交換してください。
**Kit中に含まれるMouting Solution 1 と 2 Mounting Solution 2 を 2 : 8、3:7の比率で混合 (RI = ~1.49) し、使用ください。

図1. CUBICを用いたマウス臓器丸ごとの透明化例

組織透明化プロトコル例(2mmスライス切片)

各工程使用試薬量の目安は 2.5 mL です。洗浄は 5 - 10 倍量を目安に使用ください。

**Kit中に含まれるMouting Solution 1 と 2 Mounting Solution 2 を 2 : 8、3:7の比率で混合 (RI = ~1.49) し、使用ください。

図2.CUBICを用いたマウス組織スライスの透明化例

蛍光タンパク質発現組織適応プロトコル例

各工程使用試薬量の目安は 12 - 15 mL です。洗浄は 5 - 10 倍量を目安に使用ください。

*2 日ごとに新しい溶液に交換してください。
**Kit中に含まれるMouting Solution 1 と 2 Mounting Solution 2 を 2 : 8、3:7の比率で混合 (RI = ~1.49) し、使用ください。
***下記データでは、【PI 5 µg/mL in PBS (NaCl 1.5 M), 0.05 % NaN3】を使用しています。

図3.CUBIC処理(PI染色)したCAG-EGFP Tg マウスをLSFMを用いて臓器丸ごと観察

免疫組織染色プロトコル例

脳組織ブロックの免疫染色例です。詳細なプロトコルは参考文献(1)をご覧ください。

*2 日ごとに新しい溶液に交換してください。
** それぞれ下記の溶液で抗体を希釈しています。
  1次抗体:0.1% (v/v) Triton X-100, 0.5% (w/v) bovine serum albumin, 0.01% (w/v) sodium azide in PBS
  2次抗体:0.1% (v/v) Triton X-100, 0.1% (w/v) bovine serum albumin, 0.01% (w/v) sodium azide in PBS
*** Kit中に含まれるMouting Solution 1 と 2 Mounting Solution 2 を 2 : 8、3:7の比率で混合 (RI = ~1.49) し、ご使用ください。

 

 

使用抗体
【1次抗体】
Goat anti-Copeptin (1: 100)
Rabbit anti-VIP (1: 300)
【2次抗体】
Donkey anti-goat Alexa 546 (1: 750)
Donkey anti-rabbit Alexa 647 (1: 750)

図4. CUBIC処理した脳組織ブロックを3次元免疫染色し単一光子顕微鏡で観察

アプリケーション

病理学的手法との組み合わせ例

Data by S. Nojima.et al. : Scientific Reports, 7, 9269 (2017) / Adapted.

図5.CUBIC処理したヒト臓器片例

-CUBIC処理後、パラフィン包埋、薄切、HE染色が可能-


図6.CUBIC処理したヒト病理組織検体を共焦点顕微鏡で観察

魚類透明化例

データ提供元:東京海洋大学 海洋生物資源学部門 二見邦彦先生

図7.CUBICを用いた魚類透明化例
プロトコルは参考文献5)を参照ください。
図8.CUBIC処理した魚類臓器片例

-CUBIC処理後、5 µmで薄切し、マイヤーヘマトキシリン染色が可能-

図9.CUBIC処理したゼブラフィッシュえら臓器片を抗体を用いて観察

甲殻類(カニ・ダンゴムシ)透明化例

データ提供元:浜松医科大学 医学分光応用寄附研究室 紺野在先生、岡崎茂俊先生

図10.CUBICを用いた甲殻類透明化例(上:カニ、下:ダンゴムシ)
プロトコルは参考文献6)を参照ください。
図11.CUBIC処理(PI染色)した甲殻類をまるごと観察(左:カニ、右:ダンゴムシ)
プロトコルは参考文献6)を参照ください。

甲虫(カナブン・カブトムシ・オオクワガタ)透明化例

データ提供元:東京大学大学院理学系研究科生物科学専攻 黒田真也先生

甲虫の透明化は、固定、漂白、透明化の工程が必要になります。
詳しいプロトコルはこちらを参照してください。

図12. CUBICを用いた甲虫透明化例(左:カナブン、真中:カブトムシ、右:オオクワガタ)
参考文献7) から改変

マウス全脳血管ネットワークの可視化例

データ提供元:Miyawaki, T. et al. : Nat Commun., 27, 11(2020).

図13. 胆汁酸塩(SDC)を用いたマウス脳の透明化

(上)脱脂にSDSを用いて透明化。組織の膨張が見られる。
(下)脱脂にSDCを用いて透明化。組織の膨張は抑制され、脳の白質も透明化されている。

プロトコルは参考文献8) をご参照ください
図14. 血管鋳造後に透明化したマウス脳皮質

(左)脱脂にSDSを用いて透明化。矢印部分に血管の断裂が見られる。
(右)脱脂にSDCを用いて透明化。断裂はほとんど見られない。

プロトコルは参考文献8) をご参照ください

参考文献

  1. E. A. Susaki. et al. : Cell, 157(3), 726 (2014).
  2. K. Tainaka. et al. : Cell, 159(4), 911 (2014).
  3. E. A. Susaki. et al. : Nature Protocols, 10, 1709 (2015).
  4. S. Nojima. et al. : Scientific Reports, 7, 9269 (2017).
  5. S. Ohnuma. et al.: Fish Pathology, 52(2), 96(2017).
  6. A. Konno and S. Okazaki.: Zoological Letters, 4:13(2018).
  7. M Kuroda and S Kuroda (2020). Whole-body clearing of beetles by successive treatment of hydrogen peroxide and CUBIC reagents.
  8. Miyawaki, T. et al. : Nat Commun., 27, 11(2020).

製品一覧

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  • 掲載されている試薬は、試験・研究の目的のみに使用されるものであり、「医薬品」、「食品」、「家庭用品」などとしては使用できません。
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