CUBIC Trial Kit

• 操作が簡単(溶液に浸漬するだけ)
• 臓器を丸ごと透明化
• マウス全脳を2週間で透明化可能

透明化可能組織

マウス脳・全組織、霊長類の全脳、魚類・甲殻類・甲虫などの全組織、骨 (脱灰処理が必要)

CUBIC Trial Kit キット構成

1. ScaleCUBIC-1 Solution 250 mL x 1本
2. ScaleCUBIC-2 Solution 250 mL x 1本
3. Mounting Solution-1 40 mL x 1本
4. Mounting Solution-2 40 mL x 1本

透明化に必要なもの

試薬

1. CUBIC Trial Kit
2. パラホルムアルデヒド (製品コード160-16061)
3. 1×PBS (製品コード164-25511)

器具

1. 5 mL/15 mL/30 mL/50 mL　コニカルチューブ (サンプルに合わせて使用)
2. シーソーシェーカー
3. CUBIC透明化標本向け蛍光顕微鏡^※と推奨対物レンズ^※※

• 共焦点顕微鏡、2光子顕微鏡、ライトシート顕微鏡
• ※屈折率（RI=1.49）に合った対物レンズをご用意ください。

データ取得前にお手持ちの顕微鏡メーカーに確認することを推奨いたします。

• 組織透明化プロトコル例（臓器丸ごと）
• 組織透明化プロトコル例（2mmスライス切片）
• 蛍光タンパク質発現組織適応プロトコル例
• 免疫組織染色プロトコル例

組織透明化プロトコル例（臓器丸ごと）

組織透明化プロトコルにおいてはサンプルサイズにより、使用する試薬量、処理時間が変わるので注意が必要です。また、サンプルはできるかぎり灌流固定後に摘出・再固定してください。

各工程使用試薬量の目安は 12 - 15 mL です。洗浄は 5 - 10 倍量を目安に使用ください。

＊2日ごとに新しい溶液に交換してください。
＊＊Kit中に含まれるMouting Solution 1 と 2 Mounting Solution 2 を 2 : 8、3：7の比率で混合 (RI = ～1.49) し、使用ください。

組織透明化プロトコル例（2mmスライス切片）

各工程使用試薬量の目安は 2.5 mL です。洗浄は 5 - 10 倍量を目安に使用ください。

＊＊Kit中に含まれるMouting Solution 1 と 2 Mounting Solution 2 を 2 : 8、3：7の比率で混合 (RI = ～1.49) し、使用ください。

蛍光タンパク質発現組織適応プロトコル例

各工程使用試薬量の目安は 12 - 15 mL です。洗浄は 5 - 10 倍量を目安に使用ください。

＊2 日ごとに新しい溶液に交換してください。
＊＊Kit中に含まれるMouting Solution 1 と 2 Mounting Solution 2 を 2 : 8、3：7の比率で混合 (RI = ～1.49) し、使用ください。
＊＊＊下記データでは、【PI 5 µg/mL in PBS (NaCl 1.5 M), 0.05 % NaN₃】を使用しています。

免疫組織染色プロトコル例

脳組織ブロックの免疫染色例です。詳細なプロトコルは参考文献(1)をご覧ください。

*2 日ごとに新しい溶液に交換してください。
** それぞれ下記の溶液で抗体を希釈しています。
　　1次抗体：0.1% (v/v) Triton X-100, 0.5% (w/v) bovine serum albumin, 0.01% (w/v) sodium azide in PBS
　　2次抗体：0.1% (v/v) Triton X-100, 0.1% (w/v) bovine serum albumin, 0.01% (w/v) sodium azide in PBS
*** Kit中に含まれるMouting Solution 1 と 2 Mounting Solution 2 を 2 : 8、3：7の比率で混合 (RI = ～1.49) し、ご使用ください。

図4. CUBIC処理した脳組織ブロックを3次元免疫染色し単一光子顕微鏡で観察

• 病理学的手法との組み合わせ例
• 魚類透明化例
• 甲殻類（カニ・ダンゴムシ）透明化例
• 甲虫（カナブン・カブトムシ・オオクワガタ）透明化例
• マウス全脳血管ネットワークの可視化例

病理学的手法との組み合わせ例

Data by S. Nojima.et al. : Scientific Reports, 7, 9269 (2017) / Adapted.

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魚類透明化例

データ提供元：東京海洋大学　海洋生物資源学部門　二見邦彦先生

図8．CUBIC処理した魚類臓器片例

－CUBIC処理後、5 µmで薄切し、マイヤーヘマトキシリン染色が可能－

甲殻類（カニ・ダンゴムシ）透明化例

データ提供元：浜松医科大学　医学分光応用寄附研究室　紺野在先生、岡崎茂俊先生

甲虫（カナブン・カブトムシ・オオクワガタ）透明化例

データ提供元：東京大学大学院理学系研究科生物科学専攻　黒田真也先生

甲虫の透明化は、固定、漂白、透明化の工程が必要になります。
詳しいプロトコルはこちらを参照してください。

図12. CUBICを用いた甲虫透明化例(左：カナブン、真中：カブトムシ、右：オオクワガタ)

参考文献7) から改変

マウス全脳血管ネットワークの可視化例

データ提供元：Miyawaki, T. et al. : Nat Commun., 27, 11(2020).

1. E. A. Susaki. et al. : Cell, 157(3), 726 (2014).
2. K. Tainaka. et al. : Cell, 159(4), 911 (2014).
3. E. A. Susaki. et al. : Nature Protocols, 10, 1709 (2015).
4. S. Nojima. et al. : Scientific Reports, 7, 9269 (2017).
5. S. Ohnuma. et al.: Fish Pathology, 52(2), 96(2017).
6. A. Konno and S. Okazaki.: Zoological Letters, 4:13(2018).
7. M Kuroda and S Kuroda (2020). Whole-body clearing of beetles by successive treatment of hydrogen peroxide and CUBIC reagents.
8. Miyawaki, T. et al. : Nat Commun., 27, 11(2020).