オキシトシン ELISAキットワコー Oxytocin ELISA Kit Wako

検体について

測定可能な検体は何ですか。

ヒト唾液 / 血清 / 血漿 / 尿、マウス血清 / 血漿、ラット血清 / 血漿で測定可能なことを確認しています。

必要な検体量はどのくらいですか。

n=1の最低必要検体量は50 μLです。キット付属の緩衝液で薄めても検出可能です。n=2では200 μLを推奨検体量としています。200 μLが必要なのは、前処理液2を添加し、遠心分離した後に生じる「ゲルを含む沈殿」を吸い込むことなく上清を分取するためです。(ゲルを吸い込まなければ、原理上200 μLより少ない検体でも測定は可能です)

検体の保存はどのようにすればよいですか。

検体を長期保存する場合は、検体にプロテアーゼ阻害剤である100KIU/mL アプロチニン(例: 製品コード 018-18111)と防腐剤である1/750 量（v/v）Proclin™950 を添加し、- 80℃以下での凍結保存を推奨します。
なお唾液検体の場合は、アプロチニンやProclin™ 950を添加しなくても、室温であれば6時間、冷蔵であれば24時間、-20℃であれば1ヶ月、-80℃であれば6ヶ月は測定値があまり変わりませんでした。(室温, 0時間での測定値に対する変化率が±15%以内)
なお繰り返しの凍結融解はできるだけ避けてください。当社では4回以上凍結融解すると測定値が15%以上変動することを確認しています。

唾液検体の採取はどのような方法が良いですか。

測定用の唾液採取には流涎法を推奨しています。流涎法とはバイアルやチューブなどに唾液を垂れ流すことで検体を採取する方法です。
コットンおよび不活化ポリマー素材のスワブで採取した場合にも、流涎法と同程度に測定が可能なことを確認しておりますが、スワブの素材によっては、測定対象が吸着する可能性がありますのでご注意ください。

血漿をサンプルとする時の抗凝固剤は何を使用すれば良いですか。

当社では抗凝固剤としてEDTA、へパリン、くえん酸を用いた血漿で、測定可能なことを確認しています。

前処理について

検体の前処理で、静置時間を延ばすことはできますか。

検体前処理液1の処理時間は延長しないでください。前処理液1は酸を含む溶液のため、添加後、検体は酸性状態になります。長時間の静置は検体マトリックスの変性が懸念されます。
検体前処理液2の処理時間は多少(1～4分程度)延びても問題ありません。標準の処理時間である5分は下回らないでください。

前処理で注意すべきポイントはありますか。

検体前処理液2に含まれるゲルは攪拌後時間が経過すると沈降するため、時々攪拌を加え、沈降に注意しながら添加してください。ゲルが十分に懸濁できておらず、添加するゲル量が不足している場合、反応阻害物質の除去不良のため異常値になる(B₀のRLU＜検体のRLU)可能性があります。また測定試料に検体前処理液2のゲルが混入すると異常値の原因となりますので、上清の分取時にゲルを吸い込まないようご注意ください。

粘性の高い唾液検体はどのように前処理すれば良いですか。

粘性の強い唾液は、本キットの添付文書に記載している前処理のみでは期待する測定値が得られない場合があります。その場合にはあらかじめアプロチニンとProclin™950を添加した唾液を一度凍結融解し、遠心分離 (例: 5,000 g, 10分, 4℃）後の上清を検体として、本キットの添付文書に記載する前処理に進んでください。

前処理後の検体は保管可能ですか。

前処理した検体の保管は推奨していません。どうしても検体を保管しなければならない場合、密閉したポリプロピレンまたはポリエチレン製のチューブにて冷蔵(2-10℃)で保管し、翌日測定してください。測定時に不溶解物がみられる場合には、遠心分離等で除去し、上清を測定用検体としてください。

脳破砕液サンプルに検体前処理液１を入れると白濁しますが、このまま進めてもよいですか。

検体中のタンパク質濃度が高い場合や細胞破砕残物等が多く含まれている場合には、変性による白濁が発生するケースがございます。 その後、検体処理液2を添加し、ゲルを遠心分離で除いた上清中に白濁した不溶解物がない状態であれば、処理検体として測定に用いていただいて問題ありません。 不溶解物が残る場合は、遠心ｇを10,000 g程度に上げるか、0.2 μｍフィルター処理を実施した後に処理検体としてご使用ください。

測定対象について

バソプレッシンとの交差性はどの程度ですか。

[Arg8]-バソプレッシンとの交差性は0.79%です。

メソトシン、イソトシン、バソトシンの測定は可能ですか。

メソトシン、イソトシン、バソトシンについてはデータがございません。

キットについて

本キットの抗体を購入することは可能ですか。

抗体単体での販売はしておりません。

本キットの標準品 (オキシトシン)はどのようにして値付けを行っていますか。

本キット 標準品のオキシトシン濃度はWHO世界標準品 (OXYTOCIN 4th International Standard NIBSC code: 76/575) を用いて、値付けを行っております。

プレートは分割使用できますか。

いずれもセパレートタイプのプレートを使用しており、１列(8ウェル)毎に取り外しできるため、キットの分割使用が可能です。使用する分だけ取り外して、残りは冷蔵保管していただくと使用期限内は安定です。なお、プレートシールは使用するウェル分だけハサミ等で切ってご使用ください。

キットの使用について

本キットで測定する際に必要な試薬、器具、装置は何ですか。

本キットの使用には以下の試薬、器具、装置が必要です。本キットは高感度な競合法を採用しているため、プレートシェーカーおよび発光測定用プレートリーダーが必要となります。

• 精製水（蒸留水）
• 標準溶液 / 検体希釈用チューブ
• 洗浄液希釈用ガラス器具（メスシリンダー・ビーカー）
• チップ交換型ピペット（使い捨てチップで10 μL を正確にピペッティングできるもの、および200～500 μLを正確にピペッティングできるもの）
• 連続分注ピペット、100 μLを連続分注できるもの
• ペーパータオル等の吸水性のあるもの（洗浄後にプレートに残った液を取り除く）
• 攪拌器（Vortex タイプ）
• マイクロプレート振とう器（約600～800 rpm）
• 96ウエルプレート用洗浄機（あれば好ましい）または洗浄瓶
• 96ウエルプレートリーダー（発光測定用）
• データ処理ソフトウェア

使用できるプレートリーダーにはどのようなものがありますか。

本キットの測定には発光測定用のプレートリーダーが必要となります。
当社では以下の装置を取り扱っております。
Infinite^® 200PROシリーズ (TECAN)
Spark^® (TECAN)
SpectraMax^® iD3/iD5 (モレキュラーデバイスジャパン)

プレートリーダーの測定条件をお教えください。

一例として、Tecan社 Infinite M200 PROを使用した時の条件を下記に示します。
装置: Tecan Infinite M200 PRO
ソフトウェア: PlateManegerV5
測定タイプ： エンドポイント測定
測定モード： 発光強度
プレートサイズ： 12 x 8
ウェルスキャンサイズ： 1 x 1
波長数： 1
測定値換算： W1
測定値単位： RLU
アテニュエーション1： AUTOMATIC
インテグレーションタイム1： 500 ms
セトルタイム1： 300 ms

プレートシェーカーはどのようなものを選べば良いですか。

ELISAプレートを500 rpm程度で攪拌できるシェーカーが必要です。
当社では以下の装置を取り扱っております。
プレートシェイカーMS 3 basic (IKA, コードNo. 627-05691 )
ELISAプレートの攪拌には以下、アタッチメント(別売)も必要です。
MS3.4 マイクロプレート用アタッチメント (IKA, コードNo. 620-05681 )

本キットを使って受託サービスを提供することは可能ですか。

可能です。

トラブルシューティング

検量線が上手く引けない場合、どのようにすれば良いですか。

競合反応は可逆的ですが、ビオチン標識オキシトシン溶液添加後、標準品や検体を加えるまでに時間がかかりすぎてしまうと、バラつきの増加や、ベース発光強度の上昇が起こり、検量線の傾きが得られないことがあります。
検体や標準品は10-15分(競合反応時間の約1/10以内)を目安に添加を完了してください。検体数が多い場合には、フレキシブルプレート等に検体を分注し、マルチチャンネルピペットで分注すると効率的です。

バックグラウンドよりも検体の測定値が高くなる場合、どうすれば良いですか。

前処理で検体中の反応阻害物質が除去できていないと、バックグラウンドよりも検体のRLUが高くなる(競合ELISAにおいてB₀のRLU＜検体のRLU)場合があります。特に検体前処理液2に含まれるゲル量が不足していると反応阻害物質が除去できないことがあります。ゲルは攪拌後時間が経過すると沈降するため、時々攪拌を加え沈降に注意しながら添加してください。また前処理後の試料に検体前処理液2のゲルが混入すると異常値の原因となりますので、上清の分取時にゲルを吸い込まないようご注意ください。

低濃度域の測定が上手くできない場合、どうすれば良いですか。

各工程の攪拌を十分に行ってください。特に注意すべきは以下の工程です。

■ 検体あるいは標準品の添加直後
十分に攪拌が必要です。連続的に攪拌を行うより、一旦停止し再度攪拌を開始する方が均一に混和されます。目安として[マイクロプレート振とう器で600-800 rpmで10秒間攪拌→一旦停止→再度攪拌]を3回繰り返すことを推奨します。

■ 競合反応中
推奨の攪拌速度は500 rpmです。攪拌の速度や強度が不足している場合、低濃度域における反応性が低下する恐れがあります。

■ ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン溶液の添加直後
検体や標準品の添加直後と同様に十分な攪拌が必要です。目安として[マイクロプレート振とう器で600-800 rpmで10秒間攪拌→一旦停止→再度攪拌]を3回繰り返すことを推奨します。

洗浄時、ウェルの中に泡が残る場合、どうすれば良いですか。

洗瓶等を用いたマニュアル洗浄の場合、最終回数の洗浄のみ洗浄液をオーバーフローさせて泡を回避する方法をお試しください。洗浄にはキット付属の洗浄液をご使用ください。超純水はハングリーウォーターとも呼ばれ、接する物質を取り込む性質が強く、抗原抗体結合物等への影響が懸念されるため、洗浄には使用しないでください。

発光強度が高くなりすぎる場合、どうすればよいですか？

以下2点をご確認ください。
1.ビオチン標識オキシトシン溶液添加後、次の標準溶液や検体を加えるまでに時間がかかっていないか？
2.発光試薬を室温化させてから使用しているか？

上記で改善されない場合、インテグレーションタイム（測定時間）の短縮、減衰フィルターの使用をご検討ください。