アイソスピン プラントRNA (DNase Iなし) ISOSPIN Plant RNA (w/o DNase I)

本キットは、「ISOSPIN Plant RNA」 にDNase Iが添付されていない50回用のパッケージです。
冷凍保存（-20℃）が必要な酵素が含まれていないため、本キットは室温で保存が可能です。
別売りのDNase I (RNase free)と組み合わせてご使用ください。

特長

• 高純度RNA

  遠心分離による夾雑物の除去とシリカメンブレン上でのDNase I ^*処理により高純度なRNA抽出が可能です。
  ＊：本キットにはDNase Iは含まれておりません。

• フィルターによる前処理が不要

  試料のホモジナイズやろ過を目的としたフィルター処理を必要としません。本キットは遠心分離により夾雑物を沈殿して除去します。

• フェノール、クロロホルムが不要

  フェノールやクロロホルムなどの毒性有機溶媒は使用しません。

• 抽出困難な植物試料（松葉やバラ）にはAssist Buffer添加

  いままで困難だったマツ（葉）、バラ（葉、花弁）、ツバキ（葉）、ブドウ（果肉、外皮）などからも効率よくRNA抽出可能です。　

プロトコール

RNA収量の目安

本品で得られるRNAの収量の目安は次の通りである。

試料

ホウレンソウ（葉）	0.5 μg RNA/mg tissue
ブロッコリー（芽生え）	1.0 μg RNA/mg tissue
キャベツ（種子）	1.3 μg RNA/mg tissue
キャベツ（芽生え）	1.4 μg RNA/mg tissue
キャベツ（葉）	0.1 μg RNA/mg tissue
タケ（葉）	0.3 μg RNA/mg tissue
チューリップ（球根）	0.2 μg RNA/mg tissue

シロイヌナズナの葉からのRNA抽出(RNA品質の比較)

ISOSPIN Plant RNA およびA社RNA抽出キットを用いて、シロイヌナズナの葉から各社プロトコールに従いRNAを抽出した。抽出したRNAの品質を、バイオアナライザ(Agilent Technologies社)によるRIN値の測定、アガロースゲル電気泳動、および吸光度測定により比較した。

<吸光度測定結果とRIN値>

抽出キット	A260/A280	A260/A230	RNA收量 (ng/mg tissue)	RIN值*
① A社	1.95	1.13	72	7.8
② ISOSPIN Plant RNA	2.35	2.69	79	7.5

*n=2

結果

ISOSPIN Plant RNAで抽出したRNAは、A社キットで抽出したRNAと比べて、より高品質であることが確認できた。また電気泳動では、各サンプルの吸光度に基づき同じRNA量を泳動しているが、ISOSPINで抽出したRNAはバンドが濃く、高純度であることが示唆された。

シロイヌナズナの根からのRNA抽出(RNA品質の比較)

ISOSPIN Plant RNA およびA社RNA抽出キットを用いて、シロイヌナズナの根から各社プロトコールに従いRNAを抽出した。抽出したRNAは、バイオアナライザ(Agilent Technologies社)を用いたRNA Integrity Number (RIN値) の測定を行った。

<RIN値>

抽出キット	RIN値*
A社	5.8
ISOSPIN Plant RNA	7.3

*n=1

結果

ISOSPIN Plant RNA を用いて高品質なRNAを抽出できていることが確認できた。
(RNA量が微量のため、両キット共に吸光度測定や電気泳動での検出はできなかった)

キャベツ（アブラナ科）種子および葉からのRNA抽出

ISOSPIN Plant RNAと他社製品を用いて、プロトコールに従ってキャベツの種子（約4 mg）および葉（約30 mg）からRNAを抽出した。抽出したRNAは、吸光スペクトル測定およびゲル電気泳動により比較した。さらに、抽出したTotal RNAを鋳型に逆転写を行い、得られたcDNAをGeneAce SYBR™ qPCR Mix α Low ROXを用いてリアルタイムqPCRを行った。

実験条件

1. サンプル量
   • 種子（約4 mg）
   • 葉（約30 mg）
2. 変性ゲル電気泳動
   • ゲル：1% Agarose S（ホルムアルデヒド変性）
   • RNA添加量：種子（1μg）／葉（0.5μg）
   • RNA Ladder：RNA添加量と同量
3. リアルタイムqPCR
   • 試薬：GeneAce SYBR™ qPCR Mix α Low ROX
   • 装置：ABI 7500 Fast
   • 鋳型cDNA：抽出したTotal RNAを鋳型に逆転写
   • 増幅鎖長：441 bp
   • テスト数： n=3

結果

吸光度スペクトル測定結果より、ISOSPIN Plant RNAはA社より低いA230の値を示し、多糖類などの夾雑物が効率良く除去できていることが分かった（図1）。

図1 吸光スペクトル測定

図2 変性ゲル電気泳動

【RNA添加量】

種子（1μg）／葉（0.5μg）

【Marker】

RNA Ladder(RNA添加量と同量)
1% Agarose S（ホルムアルデヒド変性）

図3 リアルタイムqPCR

【試薬】

GeneAce SYBR™ qPCR Mix α Low ROX

【鋳型】

抽出したTotal RNAを鋳型に逆転写

【装置】

ABI 7500 Fast

【増幅鎖長】

441 bp

【テスト数】

n=3

赤色：ISOSPIN Plant RNA

緑色：A社製品

タケ（イネ科）カルスからのRNA抽出

ISOSPIN Plant RNAと他社製品を用いて、プロトコールに従って各量のタケカルスからRNAを抽出した。抽出したRNAは、吸光スペクトル測定およびゲル電気泳動により比較した。さらに、抽出したTotal RNAを鋳型に逆転写を行い、得られたcDNAをGeneAce SYBR™ qPCR Mix α Low ROXを用いてリアルタイムqPCRを行った。

※本実験で使用した竹のカルスは、富山県立大学 荻田信二郎博士（現、公立大学法人県立広島大学）よりご提供頂きました。尚、使用したタケカルスは理化学研究所バイオソースセンターへ委託されたハチク培養細胞Pn（rpc00047）株から形成されたものです。

実験条件

1. サンプル量

   ① 約65 mg

   ② 約50 mg

   ③ 約40 mg

2. アガロースゲル電気泳動
   • ゲル：0.8% Agarose S／TAE
   • RNA添加量：最終溶出量の1/10（5 μl）
   • Marker：OneSTEP Marker6（5 μl）
3. リアルタイムqPCR
   • 試薬：GeneAce SYBR™ qPCR Mix α Low ROX
   • 装置：ABI 7500 Fast
   • 鋳型cDNA：抽出したTotal RNAを鋳型に逆転写
   • 増幅鎖長：197 bp
   • テスト数： n=3

結果

吸光度スペクトル測定結果では、ISOSPIN Plant RNAはA社より低いA230の値を示すことから、多糖類などの夾雑物が効率良く除去できていることが分かった（図1）。また、アガロースゲル電気泳動で比較した結果からも、ISOSPIN Plant RNAは効率よくRNAを抽出できていることが確認できた（図2）。

【ゲル】

0.8% Agarose S／TAE

【RNA添加量】

最終溶出量の1/10（5 μl）

【Marker】

OneSTEP Marker6（5 μl）

【試薬】

GeneAce SYBR™ qPCR Mix α Low ROX

【装置】

ABI 7500 Fast

【鋳型cDNA】

抽出したTotal RNAを鋳型に逆転写

【増幅鎖長】

197 bp

【テスト数】

n=3

チューリップ（ユリ科）球根からのRNA抽出

ISOSPIN Plant RNAとB社製品を用いて、プロトコールに従ってチューリップ球根（100 mg）からRNAを抽出した。抽出したRNAは、吸光スペクトル測定およびゲル電気泳動により比較した。さらに、抽出したTotal RNAを鋳型に逆転写を行い、得られたcDNAをGeneAce SYBRR qPCR Mix α Low ROXを用いてリアルタイムqPCRを行った。

チューリップ球根サンプルは粘性が高く、抽出が難しいとされている。右写真は、チューリップの球根を液体窒素ですり潰して粉末状にした後、1.5 mlチューブに量り取り、各社の抽出Buffer中でペッスルにてすり潰した後の様子である。チューブを逆さにして溶液の粘性を比較した。

実験条件

1. サンプル量

   100 mg

2. アガロースゲル電気泳動

   RNA添加量：最終溶出量の1/10（5 μl）

結果

ISOSPIN Plant RNAは粘性の高いチューリップ球根からもRNAを抽出できた。

Assist Buffer for ISOSPIN Plant RNA を使用して、杉の葉からのRNA抽出

杉の葉は、粉砕すると粘性物を大量に放出するため、溶液の粘性が高くなりRNA抽出が困難となる。Assist Buffer を組み合わせたISOSPIN Plant RNA オプションプロトコールで、杉の葉 30 mgからRNAを抽出できるか検討した。

実験条件

1. ① ISOSPIN Plant RNAキット単独の標準プロトコール（製品マニュアル p.3～5参照）
2. ② 本キットとAssist Buffer for ISOSPIN Plant RNA を組み合わせた通常のオプションプロトコール（製品マニュアル p.6~9）
3. ③ TEによる前処理工程後^*1、② の通常オプションプロトコール（製品マニュアル p.6のステップ ② 注釈、参照）
   *1 前処理工程：TE(pH8.0)中でペッスルで軽くすり潰し、遠心分離（13,000 x g、4℃、10分）を行う。
4. ④ TEによる前処理工程後^*1、② のオプションプロトコール、洗浄工程を改変^*2（製品マニュアル p.7のステップ ⑲ 参照）
   *2 PT Wash2 Buffer で 600 μl x 1回洗浄するところ、300 μl x 2回に変更。

結果

スギの葉は、キットのみでは抽出困難だったが、Assist Buffer for ISOSPIN Plant RNA を組み合わせたオプションプロトコールを行うことでRNA抽出可能だった。また、TEによる前処理工程や、改変して洗浄工程を加えることでより高純度なRNAを抽出できた。

Lane ① キット単独
Lane ②: Assist Buffer (-)
Lane ③: TE+Assist Buffer(通常プロトコール)
Lane ④ TE+Assist Buffer(改変洗浄プロトコール)

「ISOSPIN Plant RNA」と「Assist Buffer for ISOSPIN Plant RNA」の併用によりRNA抽出効率の改善

RNA抽出が困難な植物組織から、「ISOSPIN Plant RNA」のみ、または「ISOSPIN Plant RNA」と「Assist Buffer forISOSPIN Plant RNA」を併用してRNA抽出を行い、抽出したRNA溶液の吸光スペクトルを比較した。

結果

「ISOSPIN Plant RNA」だけではRNA抽出が困難な植物組織において、「Assist Buffer for ISOSPIN Plant RNA」と併用することにより、RNAの収量や純度を改善することができた。

効果が確認された植物組織

「ISOSPIN Plant RNA」と「Assist Buffer for ISOSPIN Plant RNA」の併用によりRNA抽出効率の改善が確認された組織。

植物組織	収量の目安 (RNA/mg tissue)
マツ(葉)*1	0.1 μg
バラ(葉)*1	50 ng
バラ(花弁)*1	80 ng
ツバキ(葉)*1	70 ng
ミカン(外皮)*1	80 ng
カキ(果肉)*1	30 ng
ブドウ(果肉) *1	10 ng
ブドウ(外皮) *1	50 ng
バナナ(果肉) *1	15 ng

植物組織	収量の目安 (RNA/mg tissue)
コチョウラン(葉)*1	20 ng
シクラメン(葉)*1	0.1 μg
イチゴ(葉)*1,*2	0.1 μg
ジャガイモ(根茎)	0.1 μg
ネギ(葉)	0.1 μg
トマト(果肉)	25 ng
トマト(種子)	60 ng
チャ(葉)	0.6 μg

*1. 「ISOSPIN Plant RNA」のみでは抽出が困難な植物組織.
*2. イチゴ(葉)はAssist Bufferの添加比率を変更することでより高純度なRNAが得られます。詳細は以下Q＆Aをご覧ください。

https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isospin-plant/isospin-plant-rna.html