Jackson社 抗-His Tag抗体

抗-His Tag抗体を使用した細胞抽出液からのHis Tag融合タンパク質発現のスクリーニングは、一般的に行われている手法です。抗-His Tag抗体は、N末端、C末端共に、発現したHis Tag融合タンパク質を検出します。

様々な細胞抽出液からのHis Tag融合タンパク質の検出

C末端His Tag融合タンパク質100 ngを、HEK 293、CHO、BL21 E. coli、Sf9 細胞抽出液に添加した。
各細胞抽出液は、還元後、100°C で5分間沸騰させ、9 μg/wellをSDSゲルに添加しローディングを行った。
A：ウェスタンブロット
ゲルをニトロセルロース膜に転写し、5% BSA PBS/0.2% Tween 20溶液でブロッキング後、Jackson社のペルオキシダーゼ (HRP)標識 ウサギ 抗-His Tag抗体 (メーカーコード：300-035-240) を 1:20,000 希釈で添加し、デジタルイメージャーで可視化した。
B： ゲルをCoomassieで染色

ペルオキシダーゼ (HRP)標識 抗-His Tag抗体を使用すると、異なる濃度や種類のHis Tag融合タンパク質を、直接、高感度で検出することができます。

２つの異なる濃度のHis Tag融合タンパク質をペルオキシダーゼ (HRP)標識 抗-His Tag抗体で検出		4種類のHis Tag融合タンパク質をペルオキシダーゼ (HRP)標識 抗-His Tag抗体で検出
His Tag融合タンパク質を還元後、100°C で5分間沸騰させ、その50、100、250 ng/wellを２つのSDSゲルに添加しローディングを行った。２つのゲルをニトロセルロース膜に転写し、Jackson社のペルオキシダーゼ (HRP)標識 ウサギ 抗-His Tag抗体(メーカーコード：300-035-240) を 1:5,000 と 1:50,000 希釈で添加し、デジタルイメージャーで可視化した。 露光時間：1:5,000 希釈 は 3秒、1:50,000 希釈 は 21秒		4種類のHis Tag融合タンパク質を還元後、100°C で5分間沸騰させ、 その50、250 ng/wellを２つのSDSゲルに添加した。２つのゲルをニトロセルロース膜に転写し、Jackson社のペルオキシダーゼ (HRP)標識 ウサギ 抗-His Tag抗体(メーカーコード：300-035-240) を1:20,000希釈で添加し、デジタルイメージャーで可視化した。 レーン 1、2 、4、５、６、８ ：C末端His Tag融合タンパク質 レーン 3、７： N末端His Tag融合タンパク質

抗-His Tag抗体と、標識 抗-ウサギ二次抗体（例：ペルオキシダーゼ (HRP)標識 ヤギ 抗-ウサギ抗体）を使用する間接検出法を用いることで、His Tag融合タンパク質のシグナルが増強されます。

サンプル（各50 ng）
レーン 1: Protein 1 (C末端His Tag融合タンパク質)
レーン 2: Protein 2 (C末端His Tag融合タンパク質)
レーン 3: Protein 3 (N末端His Tag融合タンパク質)
レーン 4: Protein 4 (C末端His Tag融合タンパク質)

ウェスタンブロットにおける4種類のHis Tag融合タンパク質の直接検出法と間接検出法の比較

沸騰させ、5% β-メルカプトエタノール(BME)を含むSDS-PAGE loading bufferで還元した4種類のHis Tag融合タンパク質各50 ng/wellを２つのSDSゲルに添加した。２つのゲルをニトロセルロース膜に転写し、各ブロットを標識した。
A：直接検出法
ペルオキシダーゼ (HRP)標識 ウサギ 抗-His Tag抗体(メーカーコード：300-035-240) 1:20,000 希釈
B：間接検出法
ウサギ 抗-His Tag抗体(メーカーコード：300-005-240) 1:5,000 希釈 を添加後、ペルオキシダーゼ (HRP)標識 ヤギ 抗-ウサギ抗体 (メーカーコード：111-035-144) 1:20,000 希釈を添加。ブロットをデジタルイメージャーで可視化した。

抗原 X に対する活性スクリーニングで単離した種々のHis Tag融合アルパカVHH組換え抗体の結合特性の変動をELISAで分析すると、異なるnanobodyの結合親和性の変化を明確に識別でき、リード化合物の選択が可能となります。

His Tag融合タンパク質をペルオキシダーゼ (HRP)標識 ウサギ 抗-His Tag抗体(メーカーコード：300-035-240)を用いてELISAで検出

抗原のコーティング：
抗原 X 1 μg/well (100 ul, 10 μg/ml)をプレートのウェルの表面に吸着させ、1% Bovine Serum Albumin (IgG-Free, Protease-Free) (メーカーコード：001-000-162) PBST溶液でブロッキングする。
サンプル：
5種類の精製されたHis Tag融合アルパカVHH組換え抗-抗原 X 抗体 (Protein 1-5)、200 ng/ml を段階希釈して添加。
検出：
ペルオキシダーゼ(HRP)標識 ウサギ 抗-His Tag抗体(メーカーコード：300-035-240) 1:20,000 希釈(100 μl /well)を添加。
プレートにTMBを添加し、室温で30分間インキュベート後、プレートリーダーを用いて620nmで測定した。

His Tagは、エピトープをプレート表面に隆起させることで、免疫試薬の接近を容易にし、立体構造依存的なタンパク質の捕捉を可能にします。また、標的タンパク質に特異的な抗体が少ない状況において、抗-His Tag抗体を用いることで、２つの異なる抗体が必要なサンドイッチELISAを行うことが可能となります。抗-His Tag抗体が標的タンパク質に融合されたHis Tag を捕捉し、標的タ ンパク質に特異的な一次抗体と、一次抗体の宿主と反応する標識二次抗体との複合体を利用することで、最適なシグナルを増幅させ、 標的タンパク質を検出します。

ウサギ 抗-His Tag抗体(メーカーコード：300-005-240)を用いたサンドイッチELISAでのHis Tag融合タンパク質の検出

Capture Antibody：
ウサギ 抗-His Tag抗体(メーカーコード：300-005-240) 1 μg/well (100 μl, 10 μg/ml)をプレートのウェルの表面に吸着させ、1% Bovine Serum Albumin (IgG-Free, Protease-Free) (メーカーコード：001-000-162) PBST溶液でブロッキングする。
サンプル：
His-Tagged SARS-CoV-2 spike protein RBD (Genscript社：Z03483-100) 20 ng/well (100 μl @ 200 ng/ml)をロードする。
Detection Antibody 1：
Human IgG anti-SARS-CoV-2 Spike S1 Antibody (Genscript社： A02038)、400 ng/ml を段階希釈して添加する。
Detection Antibody 2：
HRP Goat Anti-Human IgG, Fc_γ fragment specific (min X Bov, Ms, Rb Sr Prot) (メーカーコード：109-035-170) 1:20,000 希釈 (100 μl /well)を添加。
プレートにTMBを添加し、室温で30分間インキュベート後、プレートリーダーを用いて620nmで測定した。

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