イムノワンステップ™ ウェスタン
イムノワンステップ™ ウェスタンは、ウエスタンブロッティングにおけるブロッキング、一次抗体反応、二次抗体反応をワンステップの反応にまとめたことで、非常に迅速かつ効果的なブロッキング、抗体反応を可能にしたReady-to-Useの溶液です。
スキムミルクを用いた際と比較し、ブロッキングや抗体反応に要する時間が短縮できます。
特長
- Ready-to-Useの溶液
- ウエスタンブロッティングにおけるブロッキング、一次抗体、二次抗体を最短1時間のワンステップ反応で完了
- 従来のブロッキング試薬と比較して、洗浄回数を削減
- プロテインフリーでバックグラウンドを低減
≪ 一般的なウエスタンブロッティングの流れ ≫
使用方法
- ① ウエスタンブロッティングの転写後、メンブレンをPBS-T/TBS-Tバッファーに5分浸漬する。
- ② 一次抗体と二次抗体をそれぞれ本製品で別のチューブに希釈混合する。
- ③ 一次抗体溶液、二次抗体溶液を同じ容器に等量添加する。
- ④ 10分以内にメンブレンを ③ の溶液に浸し、室温で1～2時間振とうする。
- ⑤ PBS-T/TBS-Tでメンブレンを振とうして、3回洗浄する。
- ⑥ 発光/発色検出を実施する。
データ
従来手法との比較
各サンプルを同一ゲルにてSDS-PAGEを行い、PVDFメンブレンに転写後、分割した。それぞれのメンブレンについて、ウエスタンブロッティングでサンプル量、基質量、撮影条件を揃えてEGFPとβ-Actinを検出した。総タンパク質量は、BCA Assayでタンパク質濃度から換算し算出した。
EGFP
| Lane No. | 総タンパク質量 (ng) |
|---|---|
| 1 | 1 |
| 2 | 3 |
| 3 | 10 |
(A)： 5%スキムミルクを用いたウエスタンブロッティング
(B)： 本製品を用いたウエスタンブロッティング
所要時間 (A)：約4時間15分
所要時間 (B) : 約1時間20分
- サンプル：
- EGFP過剰発現HEK293細胞ライセート
- ゲ ル：
- スーパーセップ™エース、10-20%, 17ウェル (コード No. 198-15041)
- 一次抗体：
- 抗緑色蛍光たん白質, モノクローナル抗体 (mFX75) (コード No. 012-22541)
- 二次抗体：
- Anti-Mouse IgG HRP Conjugated
本製品を使用して、HEK293細胞で過剰発現させたEGFPを検出できた。
3.6秒の露光時間で、5%スキムミルクを用いたウエスタンブロッティングの1秒の露光時間と同等の検出感度を示した。
β-Actin
| Lane No. | 総タンパク質量 (ng) |
|---|---|
| 1 | 1 |
| 2 | 3 |
| 3 | 10 |
(A)：5%スキムミルクを用いたウエスタンブロッティング
(B)：本製品を用いたウエスタンブロッティング
所要時間 (A)：約4時間15分
所要時間 (B) : 約1時間20分
- サンプル：
- EGFP過剰発現HEK293細胞ライセート
- ゲ ル：
- スーパーセップ™エース、10-20%, 17ウェル (コード No. 198-15041)
- 一次抗体：
- 抗β-アクチン,モノクローナル抗体 (コード No. 010-27841)
- 二次抗体：
- Anti-Mouse IgG HRP Conjugated
本製品を使用して、HEK293細胞に内在するβ-Actinを検出できた。
5%スキムミルクを用いたウエスタンブロッティングよりも高感度に検出できた。
他社製品との比較
各サンプルを同一ゲルにてSDS-PAGEを行い、PVDFメンブレンに転写後、分割した。それぞれのメンブレンについて、ウエスタンブロッティングでGAPDH, EGFP, β-Actinを検出した。サンプル量、基質量、撮影条件は揃えて実施し、ブロッキングおよび抗原抗体反応は各社試薬のプロトコルに従った。
GADPHの検出
- サンプル：
- Jurkat細胞 / ヒトCD4陽性細胞 ライセート 10 μL
- 一次抗体：
- 抗GAPDH抗体 1 : 10,000
- 二次抗体：
- HRP標識抗ウサギ IgG抗体 1 : 10,000
<データ提供> N大学 K先生
本製品は他社製品Aと同程度の感度で検出できた。一方、本製品と同じく反応時間短縮を特長とする他社製品Bではほとんどシグナルが得られなかった。
EGFPの検出
| Lane No. | サンプル量 (μL) |
|---|---|
| 1 | 10 |
| 2 | 15 |
- サンプル：
- EGFP過剰発現HEK293細胞ライセート
- ゲ ル：
- スーパーセップ™エース、5-20%, 13ウェル (コード No. 197-15011)
- 一次抗体：
- 抗緑色蛍光たん白質, モノクローナル抗体 (mFX75) (コード No. 012-22541) 1 : 1,000
- 二次抗体：
- 抗マウスIgG (H+L), ヤギIgGペルオキシダーゼ結合 (コード No. 568-70441) 1 : 20,000
- 露光時間 :
- 3秒
本製品は他社製品Bよりも感度良く、EGFPを検出できた。
β-Actinの検出
| Lane No. | サンプル量 (μL) |
|---|---|
| 1 | 10 |
| 2 | 15 |
- サンプル：
- EGFP過剰発現HEK293細胞ライセート
- ゲ ル：
- スーパーセップ™エース、5-20%, 13ウェル (コード No. 197-15011)
- 一次抗体：
- 抗β-アクチン,モノクローナル抗体 (コード No. 010-27841) 1 : 1,000
- 二次抗体：
- 抗マウスIgG (H+L), ヤギIgGペルオキシダーゼ結合 (コード No. 568-70441) 1 : 20,000
- 露光時間 :
- 3秒
本製品は他社製品Bよりも非常に感度良く、β-Actinを検出できた。
製品一覧
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