化学的りん酸化試薬
化学的りん酸化試薬は、オリゴヌクレオチドの5'末端にモノりん酸基を導入するための試薬であり、核酸の機能化やライゲーション反応を担い、一般的には「Chemical Phosphorylation Reagent (略称：CPR)」と呼ばれています。
従来、5'末端のりん酸化はキナーゼなどの酵素を用いて行われており、代表的には T4 Polynucleotide Kinaseが広く利用されてきました。しかし、酵素的りん酸化は基質特異性が高く、オリゴヌクレオチドの5'末端の塩基種や二次構造などに依存してりん酸化効率が変動するという課題がありました1)。
このような背景から酵素的りん酸化に代わる手法として化学的りん酸化が注目されています。化学的りん酸化試薬は、反応性が高いりん酸化剤を用いることで、酵素を介さずに5'末端へ直接りん酸基を導入すること可能です。この手法により、基質依存性の課題を解消し、より効率的にモノりん酸オリゴヌクレオチドを合成できます。
本製品は名古屋大学の阿部教授らの研究グループが開発した化学的りん酸化試薬です2)。疎水性置換基であるニトロベンジル (Nb) タグを導入することで、DMT-ON精製と同様の原理に基づく逆相HPLCを用いた目的物の効率的な分離・精製を可能とし、高純度化を実現します。さらに、紫外光 (UV) 照射による脱保護工程により、不安定なRNAの分解を抑制できるため、5'末端モノりん酸RNAにも適用が可能です。なお、本試薬は Crafton Biotechnology からライセンス許諾 (WO2023/282245) を受けて製造販売しています。
特長
- ニトロベンジルタグを有する化学的りん酸化試薬
- 優れたカップリング効率 (最大99%)
- 5’末端りん酸化DNA/RNAのみを効率的に単離可能
- UV照射による脱保護によりRNAへの合成を実現
反応例
5’末端モノりん酸DNAの合成
5’末端モノりん酸RNAの合成
131ヌクレオチドをコードした5’末端モノりん酸RNAのHPLCプロファイルとdPAGE
Table 1. List of Chemically synthesized RNA
(a) HPLC profile of the crude RNA
(b) dPAGE image of peak 1–3 of crude HPLC profile
(5% dPAGE containing 7M urea)
HPLC condition
- Column size
- C4 (250 x 4.6 10 mmI.D., S-5 µm, 30 nm)
- Mobile phase
- A) 50 mM TEAA buffer (pH 7.0) + 5% CH3CN
B) CH3CN - Gradient
- over 20min B=5-15%
- Flow rate
- 1 mL/min
- Temperature
- 50℃
- Detection
- 260 nm
- Loop size
- 2.0 mL
(c) HPLC profile of RNA after RP-HPLC purification
(d) HPLC profile of the produced 5’-monophosphate RNA
by UV-irradiation of 5′-Nb-protected RNA
HPLC condition
- Column size
- C18 (250 x 4.6 mmI.D., S-5 µm, 12 nm)
- Mobile phase
- A) 50 mM TEAA buffer (pH 7.0) + 5% CH3CN
B) CH3CN - Gradient
- over 20min B=5-15%
- Flow rate
- 1 mL/min
- Temperature
- 50℃
- Detection
- 260 nm
- Loop size
- 2.0 mL
Figure 1. HPLC profiles and dPAGE image for RNA synthesis and UV-induced deprotection.
ニトロベンジル基の脱保護機構
〈UV照射による光脱保護条件〉
波長365 nmのUV (強度：4 mW/cm2) を10分間照射する。
参考文献
- Andrei, G., et al.: Tetrahedron, 51, 9375 (1995) .
- Ototake, M., et al.: Nucleic Acids Research, 52, 12141 (2024) .
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- 【医薬品原料】
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