ADRA キット
ADRA(Amino acid Derivative Reactivity Assay)はNAC(N-(2-(1-naphthyl)acetyl)-L-cysteine)とNAL(α-N-(2-(1-naphthyl)acetyl)-L-lysine)を用いた、化学物質の皮膚感作性評価試験の動物実験代替試験法です。OECD(経済協力開発機構)が定義する、皮膚感作性の有害性発現経路の4つのKey event(KE)のうち、感作性物質とタンパク質が結合し、複合体を形成する過程(KE1)での反応性の評価に使用できます。
本キットはOECD TG442Cに対応した、ADRAを簡便に実施できる試薬キットです。
ADRA実験操作解説動画
映像は試験における⼿技の⼀部を説明するものであり、具体的な実験手順はOECD Test Guidlineをご確認ください。
映像内の試薬濃度はOECD Test Guidline 442C 2022年6月改訂前の情報です。
最新の情報はOECD Test Guidelineの最新版をご覧下さい。なお、実験操作に変更等はございません。
OECD Test Guideline 442Cはこちらから
原理
皮膚感作性の発現は感作性物質とタンパク質が結合し複合体を形成することから始まります(KE1)。この結合は、タンパク質に含まれるシステインのチオール基またはリジンのアミノ基との共有結合によって発生します。ADRAは、タンパク質の代わりにNAC(システイン誘導体)、NAL(リジン誘導体)を用い、これらと被験物質の反応性からタンパク質との結合性を予測します。
反応性の評価は、NAC、NALの溶液と被験化合物の溶液を混合し、25℃で24時間反応させたのち、反応液中に残存するNACとNALそれぞれの濃度をHPLCで定量し、その結果を元に皮膚感作性を評価します。
- 高感度 ・・・281nmで定量するため、共溶出が少ない
- 従来法 (DPRA) の1/100濃度(20mM)で評価が可能 ・・・反応液の析出が少ない
- 結果のばらつきが小さい ・・・反応停止後にHPLC分析を実施するため、測定中の反応進行がない
- スループット性に優れる ・・・実験操作は主に96ウェルプレートとマルチチャンネルピペッターで実施
キット構成
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試薬名 梱包数 NAC 10 mL用 2 本 NAL 10 mL用 2 本 NAC Buffer (pH 8.0)プレミックス 300 mL用 2 本 NAL Buffer (pH 10.2)プレミックス 300 mL用 2 本 0.01 mol/L EDTA溶液 1 mL 2 本
使用法
Buffer プレミックスを水で溶解し、調製した後、NAC・NAL を溶解し、96 well プレート上で被験化合物と24 時間反応させ、HPLC で分析します。
Buffer プレミックス、NAC、NAL は反応に必要な量が小分けされており、溶解するだけで ADRA に使用できます。
96 wellプレート操作用シート、データ解析用シート、NAC・NAL純度情報
プレート配置図や測定結果の解析に便利なExcelファイルはこちらからダウンロードできます。
その他必要な試薬・器具
試薬
製品コード | 製品名 | 規格 | 容量 |
---|---|---|---|
204-02743 | トリフルオロ酢酸 | 和光特級 | 25 mL |
015-08633 | アセトニトリル | 高速液体クロマトグラフ用 | 3 L |
217-01031 | 超純水 * | 超微量分析用 | 1 L |
016-00346 | アセトン ** | 試薬特級 | 500 mL |
043-07216 | ジメチルスルホキシド ** | 試薬特級 | 500 mL |
* 蒸留水またはそれ以上のグレードの水(ADRAでは金属含有量が少ない水をご使用ください。)
** 被験物質を水またはアセトニトリルに溶解する場合は使用しません。
※ 陽性対照化合物として、Phenylacetaldehyde (CAS RN® 122-78-1) が必要です。
器具類
- 電子天秤…0.1 mgまで表示されるもの
- マイクロピペット…2~10 µL、10~100 µL、100~1000 µLを分取できる 3 種類
- 12連ピペット…50~150 µL分取可能なもの
- HPLCシステム…流速 0.3 mL/min で送液可能な 96 well 用遮光オートサンプラー付き
- UV検出器…フォトダイオードアレイ検出器(PDA検出器)または吸光度検出器(281 nm)
- HPLCカラム…ワコーパック®コア C18 ADRA (φ3.0×150mm) [Catalog # 233-63991]
- pH計…±0.01 pH単位まで読むことが可能で、校正用緩衝液付きであること
- インキュベーター…25℃設定が可能なもの
- 96 wellプレート
- 500 mL ポリボトル
- 試験管ミキサー
- プレートシール…島津ジーエルシー TORAST 96well Seal E Type [Catalog #370-04030-01]または同等品(密封性、耐溶剤性の高いもの)
- プレートシェイカー
- プレート遠心機
※ ADRA に使用する容器や器具類(HPLC 構成部品を除く)はすべて PP または PE 製のディスポ―サブル品を使用してください。
金属イオンが混入すると NAC が二量体化し、評価を正しく行うことができません。
ADRAプロトコル説明資料(2023年1月 ADRA技術講習会資料)
ダウンロードはこちら(PDF)
高速分析例(島津製作所(株) )
島津製作所(株)より、ADRAの高速分析例が示されています。
高速条件を用いることで10種の被験物質の試験で約50時間かかったHPLC分析が18時間で完了します。
詳しくは島津製作所(株)のホームページをご覧ください。
製品一覧
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- 掲載されている製品について
- 【試薬】
- 試験・研究の目的のみに使用されるものであり、「医薬品」、「食品」、「家庭用品」などとしては使用できません。
- 試験研究用以外にご使用された場合、いかなる保証も致しかねます。試験研究用以外の用途や原料にご使用希望の場合、弊社営業部門にお問合せください。
- 【医薬品原料】
- 製造専用医薬品及び医薬品添加物などを医薬品等の製造原料として製造業者向けに販売しています。製造専用医薬品(製品名に製造専用の表示があるもの)のご購入には、確認書が必要です。
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