Exosome フローサイトメトリー キット

PS Capture™ Exosome Flow Cytometry Kit

本製品は、ホスファチジルセリン(PS)特異的に結合するTim4タンパク質と磁気ビーズを利用したPSアフィニティー法1)によって、細胞外小胞を磁気ビーズ上に固定化し、表面マーカータンパク質をフローサイトメトリー(FCM)によって高感度に検出できます。

ご使用前に各表面マーカータンパク質に対する蛍光色素標識一次抗体、または一次抗体及び蛍光色素標識二次抗体をご用意いただく必要があります。

参考文献
  1. “A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles”, W. Nakai, T. Yoshida, D. Diez, Y. Miyatake, T. Nishibu, N. Imawaka, K. Naruse, Y. Sadamura & R. Hanayama, Sci Rep 6, 33935 (2016).

特長

  • FCMによる高感度定性解析
  • 磁気ビーズによる簡単操作
  • 検体を直接検出可能(精製不要)
  • 単離から染色まで 3 時間で完了

測定原理

対応サンプル・キット内容

  • 細胞培養上清
  • 血清
  • 血漿(ヘパリンまたは EDTA)

操作概要 基本プロトコール(2反応分)

各種サンプルの前処理フロー

  • 細胞培養上清の場合
  • 血清・ヘパリン血漿の場合
  • EDTA血漿の場合
バッファー交換(限外濾過)プロトコール

50 mLの TBS バッファーを用いて 1 mLの遠心処理済み EDTA 血漿サンプルのバッファー交換を行います。

  1. 19 mL の TBS を Vivaspin20 (100K) に添加する。
  2. 1 mL の遠心処理済み EDTA 血漿上清画分を 1.の Vivaspin20 (100K)に添加し混合する。
  3. 2.の Vivaspin20 (100K)を 4℃で遠心処理する。
  4. 上部の液が減ってきたら 10 mL の TBS を Vivaspin20 (100K)に追加する。
  5. 4℃で遠心分離処理する。
  6. 上部の液が減ってきたら 10 mLの TBS を Vivaspin20 (100K)に追加する。
  7. 4℃で遠心分離処理する。
  8. 上部の液が減ってきたら 11 mL の TBS を Vivaspin20 (100K)に追加する。
  9. サンプル液量が 1mL 以下になるまで 4℃で遠心処理する。
  10. 精製ステップへ進む。

各反応数における試薬およびサンプル使用量

細胞外小胞の単離工程では、1.5 mL 容マイクロチューブを用いた反応系(2 反応分)を基本プロトコールに設定しています。

反応スケールを大きくする場合、Exosome Capture Beads 使用量、サンプル量を下の表に従いスケールアップする必要があります。

  • 1.5 mL 容マイクロチューブ1本あたり、10 反応分が最大になります。
反応数 Exosome Capture Beads (µL) サンプル量(µL)
2 反応分
(基本)
30 100
3 反応分 40 133
4 反応分 50 167
5 反応分 60 200
6 反応分 70 233
7 反応分 80 267
8 反応分 90 300
9 反応分 100 333
10 反応分 110 367

K562 細胞培養上清に含まれるエクソソームの表面抗原解析

K562 細胞培養上清に含まれるエクソソームを、本製品および他社品(抗 CD81, CD9, CD63 抗体固相化磁気ビーズ)により単離し、蛍光標識抗 CD63、CD9、CD81 抗体を結合させた後、フローサイトメトリーによりエクソソーム表面抗原の検出を行った。

サンプル

K562 細胞培養上清 33 µL/Assay

検出抗体

PE 標識抗 CD63 抗体(製品コード:556020, BD Biosciences社)
PE 標識抗 CD9 抗体(製品コード:NB100-77915PE, Novus Biologicals社)
PE 標識抗 CD81 抗体(製品コード:NBP1-44861PE, Novus Biologicals社)

いずれの検出抗体を用いた場合も、PS Capture™ Exosome Flow Cytometry Kit は他社品に比べて、エクソソーム表面抗原を高感度に検出できることが確認できた。

血清、血漿に含まれるエクソソームの表面抗原解析

ヒト血清、ヒト血漿(EDTA 血漿、ヘパリン血漿)に含まれるエクソソームを磁気ビーズ上に固定化し、PE 標識マウス IgG アイソタイプコントロールおよび PE 標識抗ヒト CD9 抗体によりエクソソームの検出を行った。

サンプル

ヒト血清、ヘパリン血漿、EDTA 血漿(バッファー交換済み)33 µL/Assay

検出抗体

PE 標識抗 CD9 抗体(製品コード:NB100-77915PE, Novus Biologicals社)

いずれのサンプルも、PE 標識抗ヒト CD9 抗体で染色した場合に、蛍光強度ピークのシフトが確認できた。

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