TDAR(T cell Dependent Antibody Responce)

医薬品の免疫毒性試験に関するガイドラインICH S8 では、免疫毒性の標的が特定されていない場合には T 細胞依存性抗体産生試験(TDAR、T cell Dependent Antibody Reaction)が推奨されています。TDAR はT 細胞依存性抗原とされている、たとえば KLH (Keyhole limpet hemocyanin)を投与して一次抗原刺激によるIgM 性抗体の産生、更に二次抗原刺激後のクラス・スイッチによるIgG 性抗体の産生を観察します。富士フイルムワコーシバヤギではラット用の抗KLH-IgG抗体価、抗 KLH-IgM抗体価を測定するELISAキットをラインアップしています。また、サル用の抗KLH-IgG抗体価、抗 KLH-IgM抗体価もご用意しております。サル用についてはお問い合わせください。

特長

  • ラット-IgG特長

    • 短時間(全反応時間:2時間20分)で測定可能
    • 測定範囲:0.47~30 ng/mL(検量線範囲)
    • 微量な検体(希釈検体: 50 μL/ウェル)で測定可能
      ※非特異反応を回避するため、検体は500倍以上希釈
    • 環境に優しい防腐剤を使用
    • 全ての試薬が溶液タイプで即座に使用可能
    • 高い測定精度と再現性
  • ラット-IgM特長

    • 短時間(全反応時間:2時間20分)で測定可能
    • 測定範囲:3.13~200 ng/mL(検量線範囲)
    • 微量な検体(希釈検体: 50 μL/ウェル)で測定可能
      ※非特異反応を回避する為,検体は200倍以上希釈
    • 環境に優しい防腐剤を使用
    • 全ての試薬が溶液タイプで即座に使用可能
    • 高い測定精度と再現性

キットの構成

  • ラット-IgGキット

    構成品 状態 容量
    (A) KLH固相化 96 ウエルプレート 洗浄後使用 96 wells(8 x 12) / 1 枚
    (B) 抗KLHラットIgG標準溶液(300 ng/mL) 希釈後使用 200 µL / 1本
    (C) 緩衝液 そのまま使用 100 mL / 1本
    (D) HRP結合抗ラットIgG抗体 希釈後使用</td. 100 µL / 1本
    (F) 発色液(TMB) そのまま使用 12 mL / 1本
    (H) 反応停止液 (1M H2SO4) ※取扱注意 そのまま使用 12 mL / 1本
    (I) 濃縮洗浄液 (10 x) 希釈後使用 100 mL / 1本
    プレートシール 3 枚
    取扱説明書 1部
  • ラット-IgMキット

    構成品 状態 容量
    (A) KLH固相化 96 ウエルプレート 洗浄後使用 96 wells (8 x 12) / 1 枚
    (B) 抗KLHラットIgM標準溶液 (1000 ng/mL) 洗浄後使用 200 µL / 1本
    (C) 緩衝液 そのまま使用 100 mL / 1本
    (D) HRP結合抗ラットIgM抗体 希釈後使用 100 µL / 1本
    (F) 発色液(TMB) そのまま使用 12 mL / 1本
    (H) 反応停止液 (1M H2SO4) ※取扱注意 そのまま使用 12 mL / 1本
    (I) 濃縮洗浄液 (10 x) 希釈後使用 100 mL / 1本
    プレートシール 3 枚
    取扱説明書 1部

交差性

  • ラット-IgGキット

    ※交差率は、3000 ng/mL濃度時のデータ

    動物種 対象物質 反応性および反応率(%)
    Rat IgG 100
    IgM
    IgA
    IgE
    Mouse IgG
    IgM
    IgE

    ー : 交差反応性なし

  • ラット-IgMキット

    ※交差率は、2000 ng/mL濃度時のデータ

    動物種 対象物質 反応性および反応率(%)
    Rat IgM 100
    IgG
    IgA
    IgE
    Mouse IgG
    IgM
    IgE

    ー : 交差反応性なし

操作法・標準曲線例

  • 操作法(ラット-IgG、ラットIgM共通)

    KLH固相化96ウェルプレート
    ↓ 洗浄3回
    希釈検体または抗KLHラットIgG or IgM標準溶液 50 µL
    ↓ 撹拌※※、室温、1時間静置反応、洗浄3回
    HRP結合抗ラットIgG抗体 50 µL
    ↓ 撹拌※※、室温、1時間静置反応、洗浄3回
    発色液(TMB) 50 µL
    ↓ 撹拌※※、室温、20分間静置反応
    反応停止液 (1M H2SO4) 50 µL
    ↓ 撹拌※※
    吸光度測定 (主波長 450 nm、副波長 620 nm)
    室温:20~25℃

    ※洗浄液量目安:300 µL / well x 3回
    ※※撹拌目安:800 rpm - 10秒間 x 3回

  • ラット-IgGキット標準曲線例

    • プレートリーダーはSUNRISE RAINBOW (TECAN) を使用
    • 吸光度は測定環境により変動します
    • 演算処理は三次多項式を使用
  • ラット-IgMキット標準曲線例

    • プレートリーダーはSUNRISE RAINBOW (TECAN) を使用
    • 吸光度は測定環境により変動します
    • 演算処理は三次多項式を使用

バリデーションデータ

ラットIgG

  • ラット-IgG精度試験(アッセイ内変動)
    検体 A B
    1 11.2 3.93
    2 11.0 3.74
    3 11.3 3.83
    4 11.1 3.70
    5 11.5 3.99
    mean 11.2 3.84
    SD 0.190 0.121
    CV (%) 1.7 3.2

    単位:ng/mL

  • ラット-IgG再現性試験(アッセイ間変動)
    検体/測定日 E F G
    0日目 15.3 3.84 0.969
    1日目 15.3 3.84 0.954
    2日目 15.4 3.83 0.958
    3日目 15.2 3.82 0.976
    mean 15.3 3.83 0.965
    SD 0.0615 0.0067 0.0102
    CV (%) 0.40 0.18 1.1

    単位:ng/mL, n = 4

ラット-IgG添加回収試験
  • 検体C

    添加量 測定値 回収量 回収率(%)
    0.00 1.18
    0.466 1.65 0.470 101
    1.40 2.53 1.35 96.4
    2.33 3.48 2.30 98.7

    単位:ng/mL、n=2

  • 検体D

    添加量 測定値 回収量 回収率(%)
    0.00 12.5
    4.90 17.2 4.70 95.9
    10.7 23.1 10.6 99.1
    15.4 27.2 14.7 95.5

    単位:ng/mL、n=2

ラット-IgG希釈直線性試験

2血清検体を連続的に希釈用緩衝液で3段階希釈し測定した結果、直線回帰のR2は0.9992から0.9998でした。


ラットIgM

  • ラット-IgM精度試験(アッセイ内変動)
    検体 H I
    1 49.5 164
    2 47.7 166
    3 48.0 164
    4 47.6 161
    5 49.7 169
    mean 48.5 165
    SD 1.03 2.93
    CV (%) 2.1 1.8

    単位:ng/mL

  • ラット-IgM再現性試験(アッセイ間変動)
    検体/測定日 J K L
    0日目 11.1 86.5 187
    1日目 11.1 86.1 188
    2日目 11.2 86.3 188
    3日目 11.1 83.3 186
    mean 11.1 85.6 187
    SD 0.0576 1.48 0.814
    CV (%) 0.52 1.7 0.44

    単位:ng/mL, n = 4

ラット-IgM添加回収試験
  • 検体M

    添加量 測定値 回収量 回収率(%)
    0.00 47.3
    102 144 96.7 94.8
    127 172 125 98.4
    140 182 135 96.4

    単位:ng/mL、n=2

  • 検体N

    添加量 測定値 回収量 回収率(%)
    0.00 34.8
    16.8 51.9 17.1 102
    25.2 59.5 24.7 98.0
    42.0 76.7 41.9 99.8

    単位:ng/mL、n=2

KLH投与試験データ

検体:CD(SD)ラット 4匹 8w ♀
KLH:Cat No.374813(Calbiochem) 生理食塩水に溶解し1 mg/mLとした

  • IgMタイプ 抗KLH-IgM測定値

    Animals Preimmunization
    Day 0 (採血1)
    Day 19 (採血2) Dau 33 (採血4)
    1 <0.626 11.2 189
    2 <0.626 57.1 145
    3 <0.626 29.8 172
    4 <0.626 14.5 111
    希釈率 200倍 2000倍 2000倍

    単位:μg/mL、n=2

  • IgGタイプ 抗KLH-IgM測定値

    Animals Preimmunization
    Day 0 (採血1)
    Day 28 (採血3) Day 33 (採血4)
    1 <0.235 276 428
    2 <0.235 296 459
    3 <0.235 268 364
    4 <0.235 225 633
    希釈率 500倍 50000倍 50000倍

    単位:μg/mL、n=2

製品一覧

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