相互作用タンパク質同定の研究アドバイス/サポートとタンパク質同定

特定のタンパク質がヒト細胞内で相互作用する相手を見つけるには幾種類もの方法があり、タンパク質によってベストの方法があります。

主な方法は：

A）抗体による免疫沈降：

興味のあるタンパク質に対する抗体を用いて細胞抽出液を免疫沈降。ゲルで沈降物をゲル電気泳動して分子量で分け、

タンパク質バンドを切り出して質量分析機で決定。

長所：最も実験が簡単。　

短所：タンパク質に特異的な抗体を見つける必要がある

B）FLAGタグを付けて発現・免疫沈降：

特定のタンパク質にFLAGタグをつけてヒト細胞で発現させ、その細胞抽出液をFLAG抗体カラムを通して、

細胞内結合タンパク質を取り出し、ゲル電気泳動して結合タンパク質バンドを切り出して質量分析機で同定する。

長所：発現の低いタンパク質も免疫沈降できる。

短所：FLAGタグタンパク質の高発現により不自然に生じた結合タンパク質を掴む可能性がある。

C）組換えタンパク質による細胞抽出液中の結合タンパク質の精製と同定：

タンパク質全長や一部のドメインの組換えタンパク質をGST融合タンパク質として大腸菌や昆虫細胞に作らせて精製し、

グルタチオンカラムに固定して細胞抽出液の中から結合タンパク質を精製し、ゲル 電気泳動をして得られたバンドを質量分析機で同定する。

長所：どのようなタンパク質もドメインなら作ることが出来、多量の抽出液から相互作用タンパク質を決めることができる。

短所：このようにin vitroで得られた相互作用タンパク質はヒト細胞を用いたWesternで検証する必要がある。

プロトコールはこちら

１）目的タンパク質名、目的遺伝子名、生物種、細胞種、実験目的をご連絡ください。

※開示可能な範囲で構いません。

タンパク質の性質やデータベース上の相互作用タンパク質の情報を調べた上で、特異的な抗体が入手可能か、

　　独自のドメイン検索を実施して、A, B, Cのどの方法がもっとも有効かをご連絡いたします。

２）A, B, Cの実験のいずれを行う場合でも、注文者が実験を行われる場合は適切なアドバイスをいたします。

◆サポート体制

免疫沈降実験	免疫沈降可能な抗体の選び方、細胞エキストラクトの調整方法、 核・ミトコンドリアエキストラクトの調整方法、免疫沈降の作業内容のご相談・作業実施
組み換えタンパク質を用いた in vitro Screening	組み換えタンパク質を用いたin vitro Screening等の生化学実験のご相談・作業実施
その他	電気泳動、免疫沈降物のnano LC-MS/MS質量分析による同定、ウエスタンブロッティング、 ファーウエスタンブロッティングによる相互作用の検定のご相談・作業実施

３）送付頂いた細胞・組織と抗体を用いて免疫沈降を実施します。

免疫沈降やカラム精製で得られた相互作用候補タンパク質を電気泳動後、銀染色を実施します。

得られた泳動画像を送付いたしますので、解析に進めるバンドをご選択ください。

※目的のバンドが得られず解析を終了する場合、免疫沈降+電気泳動・銀染色費用をご請求させていただきます。

４）選択いただいたバンドをnanoLC-MS/MSで質量を測定後、Mascot search (MS/MS Ion Search) によりタンパク質を同定します。

得られた解析結果はメールにて送付いたします。

納品物

• Mascot Search Results(pdf)
• 同定されたタンパク質に関する付加情報資料(UniProtKB などによる)資料(pdf)
• 上記データをまとめた資料(Excel)　

• 相互作用タンパク同定サービス

作業内容	検体数	希望納入価格
細胞抽出液の準備と免疫沈降	１検体	120,000円/検体
	2検体目～	60,000円/検体
電気泳動・銀染色	１式	100,000円/式
nanoLC-MS/MS タンパク同定サービス	1検体	60,000円 (手数料10,000円含む)
	2~5検体	50,000円/検体
	6検体～10検体	40,000円/検体
	11検体～	30,000円/検体

※手数料は1検体のみご依頼の場合に発生致します。

※nanoLC-MS/MS タンパク同定サービスの詳細に関しては下記のURLをご参考ください。
https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/custom_service/products/95018.html

免疫沈降後のスメア状ゲルから分子量別の分画を作り、それぞれの主要なタンパク質を同定することが可能です。 Scoreは同定したタンパク質の確からしさを表し、Score＞30はタンパク質の1個以上のペプチドのアミノ酸配列がデータベースと一致した場合で有意な同定を示します。
㈱プロテオミクスでは免疫沈降後のサンプルでの電気泳動後の主要タンパク質の多数同定実績(1レーンから100以上のタンパク質同定実績)がございます。
※低濃度のタンパク質がターゲットの場合、1バンド毎の解析をおすすめいたします。

日本プロテオミクスが協力して発表したタンパク質相互作用の論文例

Scientific Reports 2020, doi.org/10.1038/s41598-020-78539-0,
Mol Neurobiol. 2020, doi: 10.10007/s12035-020-02057.
Mol Therapy, 2020, doi: 10.1016/j.ymthe.2020.02.006
Oncogene.2019,doi: 10.1038/s41388-018-0647-8
PLOS One., 2017 doi: 10.1371/journal.pone.0188320..
MolCell Biol.2017, doi: 10.1128/MCB.0023717 2015., doi: 10.1016/j.molcel.2015.03.023.
MolCell,53, 2014, doi: 10.1016/j.molcel.2013.
J. Biol. Chen. 2014, doi:10. 1074/jbc.M114.565945
J. Biol. Chem.2013, doi: 10.1074/jbc.M111.338996.
Nat Genet.44, 2012, doi: 10.1038/ng.2228.
EMBO J.30, 2011, doi: 10.1038/emboj.2010.2
MolCell.2010, doi: 10.1016/j.molcel.2010.