ELISA・アッセイキット

当社では、神経疾患マーカー(Aβ, Tau, BDNF)のELISAキットをはじめ、代謝/肥満/糖尿病、細胞内代謝、免疫/炎症、エクソソーム、酸化ストレス、細胞増殖・毒性試験など幅広い分野のELISA、プレートアッセイ、イムノクロマトキットを取り扱っております。

ELISAとは?

ELISA は抗体を使った免疫学的測定法(イムノアッセイ、Immunoassay)のひとつです。Enzyme-linked immuno-sorbent assay の頭文字をとっています。「酵素結合免疫吸着測定法」、「酵素免疫測定法」と訳されています。読み方はエライザ/エライサ/イライザ/イライサと様々ですが、エライザが多いようです。

抗体は生体にとって異物である抗原が体内に入ることによって 免疫反応を起こした結果作られるタンパク質です。
イムノグロブリン(Ig)に属します。
イムノグロブリンにはG(IgG)、M(IgM)、A(IgA)、D(IgD)、E(IgE)の クラスがあります。
イムノアッセイで使われる抗体は主として IgGです。
ELISA は、目的とする物質とだけ結合する「優れた特異的結合能」と「ごく微量の物質 でも結合できる強い親和性」を持つ抗体を結合試薬として利用した測定法です。

ELISAの原理

ここでは利用頻度が最も高いサンドイッチ ELISA について説明します。通常 96 ウェルマイクロプレートを使います。

先ず、ウェルの表面に抗体を吸着させておきます(コーティング、coating とか固相化と言う)。この抗体は固相化抗体(キャプチャー抗体)と言われ、測定対象物質である抗原を捉えるために使われます。図1では都合上、抗体が1 個しか付いていないように描かれていますが、実際は数多くの抗体が吸着されています。抗体が固相化されたウェルに抗原を含む溶液(標準品、または測定試料)を加え、抗体に抗原が結合するまでの時間放置します(一次反応)。反応が終わったら余分な液を捨て、ウェルを洗います。こうすると固相化抗体に結合した抗原だけがウェルに残ります。

次に、固相化抗体が抗原を認識する場所(エピトープ)とは異なるエピトープを認識する抗体(第二抗体とか二次抗体、検出抗体と言う)を加えて、しばらく放置します。この第二抗体にはあらかじめ化学的に酵素を結合(標識)してあります。
加えられた酵素標識第二抗体は固相化抗体に結合した抗原を認識し、それに結合します。その後、余分な酵素標識第二抗体を洗い流します。

次に、酵素反応によって発色する物質(色原性基質)の溶液を加え、酵素反応を行わせると色原性基質は酵素の作用を受けて色素に変わります。
そこで反応停止液を加え酵素反応を止めてから色の濃淡を 96 ウェルマイクロプレート用の比色計で測定します。こうして固相化抗体に結合した抗原の量が色素として測定できることになります。比色定量の結果は吸光度(absorbance)として表現されるので、標準品の測定結果から横軸に抗原濃度、縦軸に吸光度をとり検量線を描きます。この検量線を用い測定試料の吸光度から試料中の抗原量を計算します。

図1に示したサンドイッチ ELISA の実施方法はもっとも基本的な方法です。酵素の分子量はかなり大きいので抗体の結合に立体障害が生じる可能性があります。また 1 分子の抗体に多くの酵素を結合させることは困難です。

そこで別なタンパクに酵素を結合させて立体障害を少なくする方法が考えられました。

下の図2のように、第二抗体はビオチンで標識します。ビオチンは分子量が非常に小さい物質です。ビオチンとはもともと生体に存在する生理活性物質ですが、これと非常に強い親和力で結合するタンパク質が卵白の中に含まれているアビジンです。このアビジンに酵素を結合させ、抗原と結合したビオチン標識第二抗体と反応させれば、立体障害を克服できます。またアビジンに結合させる酵素を増やすことにより増幅効果も期待できます。ELISA ではこのような改善方法も用いられています。

本法は、抗体-抗原-抗体の形になるので、サンドイッチ法と呼ばれています。つまり抗体がパンで抗原をハムと考えるわけです。

※本記事は、若林克己著「ELISA A to Z」(株式会社シバヤギ発行)をもとに、株式会社シバヤギで編集したものです。

 

 

株式会社シバヤギがELISAの基礎知識や実験のコツをご紹介。詳しくは下記記事をご覧ください。
【連載】なるほど !! ELISA -基礎とコツ-

第1回 ELISA とは?
第2回 ELISA の操作法とそのポイント(前編)
第3回 ELISA の操作法とそのポイント(中編)
第4回 ELISA の操作法とそのポイント(後編)

※本記事は、若林克己著「ELISA A to Z」(株式会社シバヤギ発行)をもとに、株式会社シバヤギで編集したものです。

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