Genovis社フレキシブルリンカー切断酵素「GlySERIAS」

• 融合タンパク質のGSリンカー（G₄S-, G_xS_x-）やポリグリシンリンカーを切断
• 1hr~の短い反応時間での処理が可能
• 還元剤および補酵素は不要
• 高い再現性

GlySERIAS は、融合タンパク質を消化するユニークな酵素です。
グリシン、またはグリシンとセリン残基の反復配列からなるフレキシブルリンカーを消化します。
この酵素は、ネイティブな反応条件下で活性があり、複雑な融合タンパク質の中レベルのキャラクタリゼーションを可能にします。リンカー領域は複数部位で同時に消化され、各コンポーネントが分離されます。 酵素活性の最適条件は 37°C、pH 7.6 で、インキュベーションの長さは目的の最終生成物によって異なります。
GlySERIAS はファージ K からクローニングされ、大腸菌で発現しています。本製品は His タグが含まれており、分子量は 18 kDa です。

GlySERIAS Lyophilized では融合タンパク質は不均一に消化され、異なる長さのリンカーが残った融合タンパク質が見られます。その結果、実際のリンカーの網羅率が増加し、リンカー自体の特性評価が改善されます。リンカーが修飾されている融合タンパク質の場合にはリンカー自体の評価が必要であり、GlySERIAS Lyophilizedが適しています。

GlySERIAS Immobilizedでは、酵素をアガロースビーズに固定化させることにより反応効率が向上しています。その結果、短時間での処理が可能であり、反応後に融合タンパク質に残存するリンカーは比較的均一で非常に短くなります。また、GlySERIAS Lyophilizedでは完全に消化できないような、より複雑な融合タンパク質であっても消化できる可能性があります。 融合タンパク質の特性評価や、高活性が必要な複雑な融合タンパク質を用いる場合にはGlySERIASが適しています。

融合タンパク質デュラグルチドは、フレキシブルGS リンカーを介してヒト IgG4 の Fc 領域に2つのグルカゴン様ペプチド-1 (GLP-1) 分子が連結されています。

ペプチドと Fc 領域を別々に解析することでそれぞれの翻訳後修飾を同定するため、GlySERIAS を使用してデュラグルチドを消化しました。 逆相 LC-MS によるサンプル分析により、 GlySERIASを使用したリンカー消化時にペプチドがFc 領域から完全に除去されたことを示されました。

さらに、GLP-1 ペプチドの酸化修飾が同定されました。
GlySERIAS は複数の部位で同時に消化しましたが、3 回の消化で得られた異なる Fc/2 バリアントの相対量において再現性のある結果が示されました。

二重特性T細胞誘導抗体(BiTE)は、細胞障害性T細胞とがん抗原を標的にする2つの単鎖可変断片(scFv)がリンカーによりつながった融合タンパク質です。BiTEは4つのドメインから構成され、分子内に3つのGSリンカーを有しています。

CD19受容体とT細胞のマーカーであるCD3を標的とするBiTE抗体であるブリナツモマブ(blinatumomab) とGlySERIAS Immobilizedを室温にて終夜反応させました。

反応後のサンプルをLC-MSにて分析した結果、4種類の各ドメインが検出され、GlySERIASにより3つのリンカーがすべて切断されていることが確認できました。複数のリンカーを有する融合タンパク質に対してもGlySERIASが有用であることが分かります。