遺伝子変異検出キットシリーズ
対象遺伝子(BRAF、EGFR、KRAS)における点変異、挿入変異、欠損変異を簡便、迅速、正確、安価に検出できます。
Loop Hybrid Mobility Shift Assay(LH-MSA法)を基本原理とし、変異遺伝子領域にハイブリダイズするLoop Hybrid Probe(LH Probe)の二次構造変化をポリアクリルアミドゲル電気泳動で検出します。LH-MSA法は、高価なリアルタイムPCR装置及び特異的プローブなどの特別な設備・機器を必要としません。
特長
- リアルタイムPCR法に比べて非常に安価
- 特殊な設備・機器が不要
- 操作が簡便、作業時間・手間が低減
- 1プローブで稀な変異も検出可能
- 非常に高感度
操作概要/検出原理
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操作概要
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検出原理
実験例 - 電気泳動
ヒト大腸がん組織の凍結切片またはヒト肺がん組織ホルムアミド・パラフィン包埋切片より抽出したゲノムDNAとその他コントロールDNAを用いて、各対象遺伝子(BRAF、EGFR、KRAS) における遺伝子変異を検出しました。
本実験データは、神奈川県立がんセンター臨床研究所 がん分子病態学部 松隈章一先生より提供していただきました。
BRAF遺伝子の点変異検出実験
実験条件に示すサンプルとその他コントロールDNAを用いて、BRAF遺伝子コドン600における点変異を検出しました。
結果
- BRAF V600E変異細胞株(COLO 205)と同じ位置に変異型サンプル(サンプル 4～6)のバンドを高感度で検出
- D594G(サンプル 7)という稀な変異も同じLH Probeで検出
図：点変異検出実験電気泳動結果
抗がん剤ゼルボラフは、BRAF遺伝子に変異のある患者に効果が高いことが臨床試験で明らかになっています。2011年8月、米国食品医薬品局(FDA)により、BRAF V600E遺伝子変異があり、切除不能または転移性メラノーマである場合の治療薬として承認されています。
大腸がんの約10%にBRAF遺伝子があり、BRAF遺伝子に変異がある大腸がん患者のゲノムDNAは高メチル化状態であることから、メチル化の蓄積と遺伝子変異の研究が数多く報告されています。
実験条件
- サンプル 1-7：ヒト大腸がん組織凍結切片由来ゲノムDNA
- 電気泳動ゲル：SuperSep™ Ace, 10%, 17well(推奨品)
〔定電流、20mA〕 - 泳動時間：70分(目安)
- 染色：Gel Red™ 核酸ゲル染色液(x 10000)水溶液
BRAF遺伝子 PCR増幅産物：157 bp
EGFR遺伝子のExon19欠損変異検出実験
実験条件に示すサンプルとその他コントロールDNAを用いて、EGFR遺伝子Exon19のコドン746から750における欠損変異を検出しました。
結果
- 最も品質が悪いとされるFFPE切片＊1から抽出したゲノムDNAでも変異型サンプルのバンドシフトを高感度で検出
- 挿入変異(サンプル 8)という稀な変異も同じLH Probeで検出
＊1 FFPE : ホルマリン固定・パラフィン包埋
図：欠損変異検出実験電気泳動結果
ゲフィチニブは上皮成長因子受容体(Epidermal Growth Factor Receptor;EGFR)のチロシンキナーゼの働きを阻害する作用を持ち、非小細胞肺癌(NSCLC)に対する分子標的治療薬として2002年7月に世界に先駆けて日本で承認されました。しかし本薬剤による間質性肺炎の発生が副作用として大きな問題となっています。ゲフィチニブにおいては、EGFRのチロシンキナーゼ活性部位に遺伝子変異があれば効果があることが確認されており、その検査が重要となっています。
NSCLCの20～25%のEGFR遺伝子Exon19コドン746-750を中心とする部位に欠損変異があると報告されています。
実験条件
- サンプル 1-8：ヒト肺がん組織ホルムアミド・パラフィン包埋切片由来ゲノムDNA
- 電気泳動ゲル：SuperSep™ Ace, 10%, 17well(推奨品)
〔定電流、20mA〕 - 泳動時間：70分(目安)
- 染色：Gel Red™ 核酸ゲル染色液(x 10000)水溶液
EGFR遺伝子Exon19 PCR増幅産物：146 bp
EGFR遺伝子のExon20挿入変異検出実験
実験条件に示すサンプルとその他コントロールDNAを用いて、EGFR遺伝子Exon20における挿入変異を検出しました。
結果
- 最も品質が悪いとされるFFPE切片から抽出したゲノムDNAでも変異型サンプルのバンドシフトを高感度で検出
図：挿入変異検出実験電気泳動結果
ゲフィチニブは上皮成長因子受容体(Epidermal Growth Factor Receptor;EGFR)のチロシンキナーゼの働きを阻害する作用を持ち、非小細胞肺癌(NSCLC)に対する分子標的治療薬として2002年7月に世界に先駆けて日本で承認されました。しかし本薬剤による間質性肺炎の発生が副作用として大きな問題となっています。ゲフィチニブにおいては、EGFRのチロシンキナーゼ活性部位に遺伝子変異があれば効果があることが確認されており、その検査が重要となっています。
NSCLCの約5%のEGFR遺伝子Exon20に挿入変異があると報告されています。
実験条件
- サンプル 1-7：ヒト肺がん組織ホルムアミド・パラフィン包埋切片由来ゲノムDNA
- 電気泳動ゲル：SuperSep™ Ace, 10%, 17well(推奨品)
〔定電流、20mA〕 - 泳動時間：70分(目安)
- 染色：Gel Red™ 核酸ゲル染色液(x 10000)水溶液
EGFR遺伝子Exon20 PCR増幅産物：189 bp
EGFR遺伝子のExon21点変異検出実験
実験条件に示すサンプルとその他コントロールDNAを用いて、EGFR遺伝子Exon21のL858R点変異を検出しました。
結果
- 最も品質が悪いとされるFFPE切片から抽出したゲノムDNAでも変異型サンプルのバンドシフトを高感度で検出
図：点変異検出実験電気泳動結果
ゲフィチニブは上皮成長因子受容体(Epidermal Growth Factor Receptor;EGFR)のチロシンキナーゼの働きを阻害する作用を持ち、非小細胞肺癌(NSCLC)に対する分子標的治療薬として2002年7月に世界に先駆けて日本で承認されました。しかし本薬剤による間質性肺炎の発生が副作用として大きな問題となっています。ゲフィチニブにおいては、EGFRのチロシンキナーゼ活性部位に遺伝子変異があれば効果があることが確認されており、その検査が重要となっています。
NSCLCの20～25%のEGFR遺伝子Exon21コドン858においてロイシンからアルギニンへの点変異があると報告されています。
実験条件
- サンプル 1-4：ヒト肺がん組織ホルムアミド・パラフィン包埋切片由来ゲノムDNA
- 電気泳動ゲル：SuperSep™ Ace, 10%, 17well (推奨品)
〔定電流、20mA〕 - 泳動時間：70分(目安)
- 染色：Gel Red™ 核酸ゲル染色液(x 10000)水溶液
EGFR遺伝子Exon21 PCR増幅産物：184 bp
KRAS遺伝子の点変異検出実験
実験条件に示すサンプルとその他コントロールDNAを用いて、KRAS遺伝子のコドン12および13のグリシンにおける点変異を検出しました。
結果
- 変異型サンプル(サンプル 2-7)のバンドシフトを高感度で検出
- G12D以外の変異も同じLH Probeで検出
抗がん剤セツキシマブは、KRAS遺伝子に変異のない野生型患者に効果が高いことが臨床試験で明らかになっており、厚生労働省は2010年3月23日付に発出した通知で、KRAS 遺伝子変異の有無を考慮して投与することを追記するよう指導しました。
大腸がん患者の約30%にKRAS遺伝子変異があり、KRAS遺伝子に変異がある大腸がん患者のゲノムDNAは中メチル化状態であることから、メチル化の蓄積と遺伝子変異の研究が数多く報告されています。
実験条件
- サンプル 1-7：ヒト大腸がん組織凍結切片由来ゲノムDNA
- 電気泳動ゲル：SuperSep™ Ace, 10%, 17well(推奨品)
〔定電流、20mA〕 - 泳動時間：70分(目安)
- 染色：Gel Red™ 核酸ゲル染色液(x 10000)水溶液
KRAS遺伝子 PCR増幅産物：165 bp
製品一覧
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