cDNAクローニングキット

本製品では、熱による不活性化が容易なエビ由来アルカリホスファターゼ(SAP)の脱りん酸反応と、一本鎖DNA・RNA を高効率に連結可能な耐熱性リガーゼによるアダプターライゲーション反応とを、同一の溶液中で反応させることが可能な独自の緩衝液を用います。これによって、簡便かつ高効率なアダプターライゲーションが可能になり、microRNA を容易にcDNA 化することが可能になりました。

特長

• 耐熱性リガーゼによる高効率で正確なアダプターライゲーションが可能
• ヘアピン型microRNAのクローニングに最適
• RNA操作が少なく1.5 日でmicroRNAをコードするcDNAが作製可能

従来のクローニング法との比較と改善点

	従来のマイクロRNAクローニング法の欠点	microRNA Cloning Kit Wakoによる改善
1.	アダプターライゲーションの再現性が低い。	→　再現性が高い
2.	アダプターライゲーションの際、非特異的ライゲーションが起こり、最終産物のバンドがスメアになる。	→　リガーゼおよび反応Buffer条件の改善により非特異的ライゲーションを防止
3.	脱リン酸反応後にBAPが残存するため、アダプターに対する非特異的な脱リン酸反応が起こる。	→　SAPを使用しているので完全な熱変性が可能
4.	磁気ビーズ用マグネットスタンドが必要。	→　不要
5.	100 ngのsmall RNAを使用しなければならないので、微量サンプルから抽出する際には困る。	→　50 ngで使用可能
6.	BAP処理、T4 RNA Ligase処理において、酵素反応後すべてでエタノール沈殿を行うので、small RNAをロスしてしまう。	→　SAP、耐熱性ssDNA Ligaseを同一チューブ内で反応可能
7.	アダプターのリン酸化反応工程があり煩雑。	→　リン酸化工程はありません
8.	RIを使用しないと検出できない。	→　不要
9.	T4 RNA Ligaseは反応温度が16 ℃であるため、2次構造をとるmicroRNAのクローニング効率が低いのではと心配。	→　一本鎖DNAと一本鎖RNAを55 ℃ - 65 ℃で反応可能な耐熱性リガーゼを使用するため、2次構造をとるmicroRNAのクローニング効率が上がる。

本製品は微量mRNA をcDNA 増幅するキットです。Ago タンパク質の免疫沈降RNA 画分に存在するmicroRNA と相互作用するmRNA をcDNA 化することが可能で、それらのmRNA から合成されたcDNA をクローニングして得られたDNA 配列をもとに、microRNA の標的mRNA候補をスクリーニングできます。

本製品をAgo 免疫沈降法と併用することで、従来のデータベースを用いた標的mRNA の予測法ではなく、分子生物学的手法によりmicroRNA の標的mRNA のスクリーニングが可能になりました。

特長

• シンプルなプロトコル
• 微量mRNA増幅に最適
• mRNA鎖長に影響されずに増幅可能
• Ago免疫沈降との併用で標的mRNA探索が可能

原理