EpiSight™ シリーズ

• スピンカラムによる簡便な操作
• 独自開発のエンハンサーによりDNAの分解を抑制
• CpGリッチな配列を効率よく増幅
• 非特異増幅を防ぐホットスタートDNAポリメラーゼ

下記でお悩みの方はぜひ一度お試しください。

• 長い鎖長を一度に増幅して解析を効率的にしたい
• 非メチル化シトシンがウラシルへ変換されないことがある
• メチル化シトシンがウラシルへ変換されることがある
• PCRの増幅効率を上げたい

Lambda DNAを鋳型として、本キットによりバイサルファイト反応後、910bpのターゲット領域を増幅し、塩基配列を解読した。Lambda DNAのシトシンはすべて非メチル化のため、バイサルファイト反応後はすべてウラシルに変換され、得られるPCR増幅産物にシトシンは存在しないと予想される。

結果

下図のチャートにシトシンは存在せず、150ヶ所あるシトシンはすべてチミンに変換されていた。

従来のバイサルファイト法ではDNAの分解が激しく条件設定できなかった900bp以上のPCR産物の増幅に成功した。

マウスES細胞（胚性幹細胞）およびM1細胞（白血病由来細胞）のゲノムDNAを鋳型としてバイサルファイト反応後、幹細胞未分化マーカーであるFgf4プロモーター領域のPCR増幅を行った。PCR増幅鎖長は521bp、CpGジヌクレオチド数は61ヶ所というバイサルファイトPCRとしては長い増幅鎖長であり、GC含量も高いことから立体構造の影響も大きいと予想される領域を選択した。

ES細胞およびM1細胞の幹細胞未分化マーカーの発現解析を下図に示す。ES細胞は幹細胞のため幹細胞未分化マーカーであるFgf4のmRNAが発現しており、プロモーター領域は非メチル化状態にあると予想される。一方、M1細胞は分化した体細胞のためFgf4のmRNAは発現しておらず、プロモーター領域はメチル化されていると予想される。

結果

ES細胞およびM1細胞のPCR増幅産物をクローニング後、11サンプルの塩基配列を解読した結果を下図に示す。

マウスES細胞のFgf4プロモーター領域は非メチル化状態であり、マウスM1細胞のFgf4プロモーター領域はメチル化状態にあることがわかった。

本キットのDNA分解抑制能を他社品と比較した。本キットと他社品を用いてバイサルファイト反応を行い、得られたバイサルファイト処理DNAをPCR増幅後、電気泳動を行った。

結果

本キットでは521bpのバンドが確認できたが、他社品ではほぼバンドを確認できなかった。

本キットはバイサルファイト反応によるDNA分解を抑制していることがわかった。