qNMR용 내부 표준물질 (qNMR 교정 표준물질)

내부 교정 표준물을 선정할 때는 (1) 측정 대상 화합물과 NMR 신호가 중첩되지 않아야 하며, (2) 사용되는 중수소 용매에 대한 용해도가 적합한지 확인하는 것이 중요합니다. 아래는 당사의 교정 표준물 ¹H NMR 스펙트럼^*1 및 용해도 정보에 대한 요약입니다. 측정 대상 화합물에 맞는 교정 표준물을 사용해 주십시오.

*1 ¹H NMR 차트는 조건에 따라 약간 달라질 수 있습니다.

용해도 정보

〇: 수용성　 △: 용해도가 약간 낮음　 ✖: 불용성

교정 표준물의 품질은 qNMR 측정에서 가장 중요한 요소 중 하나입니다. qNMR 기법이 제약 및 식품 분석을 비롯한 다양한 분야에서 활용되기 시작한 이유는, 신뢰도가 높은 순도나 농도가 확인된 교정 표준물(예: SI 추적성이 보장되는 교정 표준물)을 활용함으로써 다른 기존 기법에 비해 비교적 쉽게 정확한 정량 결과를 얻을 수 있기 때문입니다. 즉, qNMR의 이러한 특성상 적절한 교정 표준물을 선택하는 것이 매우 중요합니다.

qNMR에 사용되는 교정 표준물을 선택할 때 주의해야 할 점은 무엇인가요?^1,2)

• 일반적인 유기 화합물의 신호가 관찰되지 않는 특정 화학 이동도를 가진 신호(들)
• 용매에 대한 용해도가 높음
• 정확한 계량이 가능함 (즉, 흡습성이 없고, 용해성이 없으며, 비휘발성 또는 비승화성)
• 신호가 적고 스핀-스핀 결합이 적은 것 (싱글릿이 바람직함)
• 국제 단위계(SI)에 대한 추적 가능성을 갖춘 것 (예: 국가 표준, 인증 기준 물질(CRM) 등)

지금까지 qNMR에 사용되는 교정 표준물을 선정할 때의 주요 사항을 예시를 들어 살펴보았습니다. qNMR 측정 시, SI 단위계로 추적 가능한 교정 표준물을 사용하면 SI 단위계로 추적 가능한 정량값(절대 정량값)을 얻을 수 있습니다.

1,4-BTMSB-d₄ 인증 기준 물질(CRM) 및 DSS-d₆ CRM은 ¹H qNMR용 교정 표준 물질로, 상기 요건을 모두 충족합니다. 이 두 가지 CRM은 상기 요건을 모두 충족하며, 그 높은 다용도성 덕분에 일본 약전(Japanese Pharmacopoeia)의 여러 화합물에 대한 정량적 NMR(qNMR) 순도 측정 기준으로 채택되었습니다. 위 그림에는 과학 논문에 보고된 일반적인 qNMR 교정 표준물질과 일반 유기 화합물의 화학 이동이 개략적으로 표시되어 있습니다. 그림에서 볼 수 있듯이, 1,4-BTMSB-d₄와 DSS-d₆는 0 ppm 부근에서 싱글릿 신호를 나타내며, 다른 일반적인 교정 표준물질보다 일반 유기 화합물과 더 잘 분리되는 특성을 보입니다. ^{3), 4)}. 또한, 1,4-BTMSB-d₄는 유기 용매에 대한 용해도가 우수하며, DSS-d₆는 수용성 용매에 대한 용해도가 우수하다.

1. JIS K 0138: 2018
2. Miura T. et al., Analytical standards purity determination using quantitative nuclear magnetic resonance. New Horizons of Process Chemistry: Scalable Reactions and Technologies. (Tomioka K. et al.). Springer, Singapore, 275 (2017).
3. Wako Junyaku Jiho, Vol. 86 No. 1 (January 2018)
4. Inspired by Dr. Naoki Sugimoto at NIHS.

일본 약전(Japanese Pharmacopoeia)의 ‘시약/시험용 용액’ 항목에 규정된 정량적 NMR(qNMR)을 통한 순도 측정 시, 계량은 초미세 저울을 사용하여 수행됩니다. 그러나 초미세 저울의 접시가 매우 작기 때문에 작은 바이알과 같은 소형 물품만 올려놓을 수 있습니다. 또한, 이 작은 바이알을 저울 접시에 올려 놓고 용기 무게를 뺀 뒤, 주걱으로 시료를 바이알에 넣을 때 시료가 바이알 가장자리에 달라붙지 않게 하는 것은 매우 어렵습니다. 경우에 따라 시료가 바이알 외부나 저울 접시에 달라붙을 수 있는데, 이를 알아차리지 못하면 측정 결과에 큰 오차가 발생할 수 있습니다. 이러한 이유로, 알루미늄으로 만든 작은 금속 저울 접시를 용기(tare)로 사용하는 절차가 초미량 저울을 이용한 정확한 계량 방법으로서 널리 활용되고 있습니다. 이 절차는 아래 그림에 나와 있습니다. 이 방법을 사용하면 qNMR용 시료와 교정 표준물을 바이알과 같은 용기에 넣을 때, 바이알의 가장자리나 저울의 접시에 달라붙지 않게 능숙하게 배치할 수 있습니다.

여기서는 qNMR 측정 시 계량에 가장 적합한 타레(tare)로 알루미늄 계량 접시를 소개하고자 합니다. 이 알루미늄 계량 접시는 알루미늄으로 제작되어 정전기가 잘 발생하지 않습니다. 용적이 작아 공기 중의 부력 효과에 쉽게 영향을 받지 않으므로, qNMR 측정 시 정확한 계량에 적합합니다. 또한 qNMR 측정을 수행하기에 적절한 내부 용적(80 μL)을 갖추고 있습니다. 또한, 7종류의 중수소화 용매(클로로포름-d, DMSO-d₆, 중수소산, 아세톤-d₆, 아세토니트릴-d₃, 메탄올-d₄ 및 디클로로메탄-d₂)에 대해 용출 시험을 수행하였으며, 용출액에서 신호가 발생하지 않음을 확인했습니다.

또한 알루미늄 계량 접시를 담기에 적합한 넓은 입구의 쿼츠 바이알도 제공합니다.

최소 계량량이란, 사용된 저울의 측정 오차를 고려했을 때 시료의 질량을 정확하게 계량하는 데 필요한 최소 시료량을 말합니다.

제약 산업에서 미국약전(USP) 일반편 <41>; 저울 및 일반 정보 <1251>; 분석 저울을 이용한 계량은 저울 관리 방법 중 하나로 널리 활용되고 있습니다 ^1,2). 저울에서 시료를 정확하게 계량하기 위해서는 저울이 사용 범위 내에서 교정되어야 하며 다음 기준을 충족해야 합니다:

1. 반복성은 시험 추 하나를 10회 이상 계량하여 평가합니다.
2. 측정값의 표준 편차 2배를 사용자가 해당 저울에서 사용하려는 최소 순중량(즉, 사용자가 해당 저울에서 사용하려는 최소 순중량)으로 나눈 값이 0.1%를 초과하지 않으면 반복성은 만족스러운 것으로 간주됩니다.

즉, 다음의 식이 도출됩니다.

최소 중량을 평가하는 예시는 아래와 같습니다. 이 예시에서 볼 수 있듯이, 저울의 서로 다른 판독 한계(눈금 간격)에서도 동일한 정확도를 보장하기 위해서는, 저울의 판독 한계(눈금 간격)가 작을수록 계량할 수 있는 시료의 양이 더 적다는 것을 알 수 있습니다.

최소 중량의 측정 예시

용액 NMR에서는 시료를 중수소화 용매에 용해시켜 NMR 측정을 수행하지만, 사용되는 중수소화 용매는 HPLC 및 GC에 사용되는 일반 용매보다 가격이 비싸기 때문에 용매 사용량을 줄이는 것이 바람직합니다. qNMR 측정에서도 상황은 마찬가지이며, 농도가 일정하다고 가정할 때 분해능이 더 높은 저울을 사용하면 중수화 용매의 사용량을 줄일 수 있다. 실제로 일본약전(Japanese Pharmacopoeia)은 시약/시험용액(Reagents / Test Solutions) 항목에서 여러 화합물에 대해 qNMR을 이용한 순도 측정을 채택하고 있으나, 사용된 저울은 모두 초미량 저울로 명시되어 있다.^*1

*1 일본 약전에서 말하는 초미량 저울은 판독 범위(눈금 간격)가 0.1 μg인 저울을 의미합니다

1. USP "General Chapter 41 Balances", USP39-NF34, cited 29 April, (2016).
2. USP "General Information 1251 Weighing on an Analytical Balance", USP39-NF34, cited 29 April, (2016).