フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25 : 24 : 1) Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25 : 24 : 1)

本製品は、TE 飽和フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールを25：24：1 で混合した溶液です。生体組織からの核酸抽出や、核酸の酵素反応後のタンパク質除去などに用いられます。イソアミルアルコールには、使用時に発生する泡を少なくする効果があります。
本製品に使用されているTE飽和フェノール（フェノール 66％）は、フェノールをあらかじめTEで飽和させたもので、8-ヒドロキシキノリンが含まれています。

用途

• 生体組織からの核酸抽出、核酸の酵素反応後のタンパク質除去など

使用上の注意

1. フェノールのpH は、7～8 がよいとされています。これより低いと、抽出中にDNA がフェノール相へ移り収量低下の原因となり、逆に高いとフェノールの酸化速度を早めます。
2. DNA 抽出の際の塩濃度は普通、重要なファクターではありませんが、オリゴマーのような低分子DNAの場合は50 mmol/l 以上のNaCl またはKCl を添加することにより収量低下を防ぐことができます。
3. 8-ヒドロキシキノリン（8-キノリノール）には次のような利点があります。
   • ①抗酸化剤として作用します。
   • ②フェノール相が黄色になるので透明な水相と容易に区別できます。
   • ③RNase の部分インヒビターとして作用します。
   • ④Vanadyl-ribonucleotide complex (VRC) をRNase インヒビターとして使用する場合、色の変化（黄→黒）によりVRC の存在を検定できます。
4. フェノールは劇物なので、使用の際には次のような注意が必要です。
   • ①手袋や眼鏡などの保護具を着用して下さい。
   • ②皮膚や目にフェノールが触れた場合はただちに大量の流水で洗った後医師の診察を受けて下さい。
   • ③操作はフード内で行って下さい。

^*1　本製品のフェノール含有量は37%です。

Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) の性状

本製品は二層に分離した液体です。下層のフェノール層をご使用ください。

• 無色の上層：　TE
• 淡い黄色の下層：　Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol

フェノール処理の例

• 核酸水溶液（200 µL）
• ↓ ← Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 等量(200 µL) 添加
• ↓ 混和
• ↓ 遠心分離 (11000 x g, 室温, 5分～15分)
• ↓ 上に核酸を含む透明な水層、下に黄色のフェノール層、白いタンパク質を含む中間層に分かれる
• 水層を新しいチューブに移す (中間層を取らないように注意する)

酵素失活のためのフェノール抽出とエタノール沈殿による回収の例

• 核酸水溶液（100 µL）^＊1
• ↓ ←Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 等量（100 µL）添加
• ↓ 転倒混和
• ↓ 遠心分離(11,000 x g, 室温, 15分)
• 水相（上層）を新しいチューブに移す
• ↓ ←3M Sodium Acetate (pH 5.2), 0.1倍量（10 µL）添加
• ↓ ←95～100%エタノール, 2～2.5倍量（250 µL）添加
• ↓ 放置（室温で10分間、または-20°Cで30分間）
• ↓ 遠心分離(11,000 x g, 4°C, 15分)
• 沈殿（上清を取り除く）
• ↓ 70% エタノール洗浄（1 ml程添加した後、遠心分離）
• 沈殿（上清を取り除く）
• ↓ 風乾 （ 乾燥しすぎると核酸が溶けにくくなることがある）
• ↓ ←d.d. H2O(RNaseフリー)またはTE(pH 8.0)を添加
• 除タンパクされ、バッファー交換された核酸水溶液

^＊1　核酸水溶液の体積を見積ります。水相を回収する際にいくらかロスする可能性があるため、少量の場合は100 µLほどにメスアップすると操作がしやすいです。