タンパク質の特性評価に

R&D Systems SEC-MALS分析済みリコンビナントタンパク質

タンパク質の特性評価には、純度、同一性 (分子量、MW) 、オリゴマー状態 (モノマー、ダイマー、トリマー...) 、均一性 (凝集状態) といった試験項目が必要です。SEC-MALSは、タンパク質の分子量を正確かつ信頼性高く定量するための確立された手法であり、上記の指標を測定できるだけでなく、タンパク質の特性をさらに詳細に解析することが可能です。

SEC-MALS とは
SEC-MALSによるタンパク質解析
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SEC-MALS とは

SEC-MALSは、まずサイズ排除クロマトグラフィー高速液体クロマトグラフィー (SEC-HPLC) からなり、カラムを用いて試料の分画が行われます。その後、多角光散乱 (MALS) 検出器により、分離された画分の分子量 (MW) が決定されます。

SEC-MALSの機器構成

図1：SEC-MALSの代表的な構成。SEC-MALSの構成には、通常、SECカラム、UV検出器、MALS検出器、およびdRI検出器を備えたHPLC/FPLCシステムが含まれる。試料を充填すると接続されたSECカラム内を流れ、分離される。カラムから溶出された試料は、UV検出器に入り、MALS検出器を経て、最終的にdRI検出器を通過する。検出器を通過する分子の光散乱と濃度を同時に測定することで、その分子のモル質量を決定する。

SEC-MALSによる検出方法

図2：1.タンパク質試料をクロマトグラフィーにかけ、単量体、二量体、三量体をその流体力学的体積に基づいて分離する。2. 分子はUV検出器を通過し、UV光に対する分子の吸光度に基づいて組成データが得られる。 3. MALS検出器を通過する際、分子にレーザー光が照射される。分子量を決定するために、試料のレーザー光散乱を測定する検出器が少なくとも3つ配置されている。4. 試料は差分屈折率 (dRI) 検出器を通過し、この検出器は試料溶液とブランク溶媒の屈折率の変化を測定し濃度を決定する。5. これらの検出器からの出力はクロマトグラフにまとめられる。6. クロマトグラフの解析により、時間経過に伴うモノマー、ダイマー、トリマーの分離状況、およびそれらの吸光度とモル質量濃度が確認できる。

SEC-MALSの原理

第一に、SEC-HPLCの原理は、分子の分子量 (MW) ではなく、その流体力学的体積 (サイズ) や形状に基づいて、固定相 (カラム) を通過させることで分子を分離することに基づいています。第二に、MALSの原理は、偏光レーザービームをサンプル分子に照射し、その散乱光を複数の角度 (少なくとも3つの角度) から検出することにあります。MALS検出器と2つの濃度検出器を併用することで、タンパク質修飾の分子量および重量分率を測定することができます。

図3： (A) SEC-MALSによるBSAの分析結果を示すグラフの例。 (B) Aのグラフを拡大したもので、SEC-MALSを用いてBSAの単量体・二量体・三量体が分離されている様子を示す。

SEC-MALSによるタンパク質解析

Recombinant Human TNF-alpha

SEC-MALS Data	Result
Retention Time	18.5 - 19.0 min
MW-Predicted (Monomer)	17.0 kDa
MW-MALS	53.1 kDa
Polydispersity	1.000
System Suitability: BSA Monomer 66.4 ± 3.32 kDa	Pass

組換えヒトTNF-α (コード 210-TA) の分子量 (MW) は、SEC-MALSによる分析の結果、53.1 kDaであり、このタンパク質がホモトリマーであることが示唆された。分子量は、翻訳後修飾 (例グリコシル化) により、予測分子量と異なる場合がある。

Recombinant Human IFN-gamma

SEC-MALS Data	Result
Retention Time	18.3 - 18.8 min
MW-Predicted (Monomer)	16.9 kDa
MW-MALS	34.9 kDa
Polydispersity	1.001
System Suitability: BSA Monomer 66.4 ± 3.32 kDa	Pass

組換えヒトIFN-γ (コード 285-IF) は、SEC-MALSによる分析の結果、分子量 (MW) が34.9 kDaであり、このタンパク質がホモダイマーであることが示唆された。分子量は、翻訳後修飾 (例グリコシル化) により、予測分子量と異なる場合がある。

Recombinant human FGF basic/FGF2/bFGF

SEC-MALS Data	Result
Retention Time	16.0 - 16.6 min
MW-Predicted (Monomer)	16.0 kDa
MW-MALS	17.2 kDa
Polydispersity	1.001
System Suitability: BSA Monomer 66.4 ± 3.32 kDa	Pass

組換えヒトFGF basic／FGF2／bFGF、145アミノ酸、TCグレード (コード 4114-TC) は、SEC-MALSによる分析の結果、分子量 (MW) が17.2 kDaであり、このタンパク質が単量体であることが示唆された。分子量は、翻訳後修飾 (例グリコシル化) により、予測分子量と異なる場合がある。

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SEC-MALC 分析済みタンパク質

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